現(xiàn)代魚病的診斷技術(shù)

　　隨著我國魚類養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和集約化水平的提高，各種魚類病害的發(fā)生日益頻繁，危害也越來越嚴(yán)重，已成為制約整個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的最重要的因素之一。目前，在中國廣為流行的水產(chǎn)動物疾病（病害）就達(dá)100種以上，每年因疾病所造成的產(chǎn)量損失達(dá)20%以上，經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)百億元。日益嚴(yán)峻的現(xiàn)實(shí)使我們認(rèn)識到，控制水產(chǎn)動物疾病已迫在眉睫，尋求水產(chǎn)動物病害的有效防治方法越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，其中水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病原的快速、準(zhǔn)確檢測是對水產(chǎn)動物病害進(jìn)行有效防治的基礎(chǔ)和先決條件。因此，建立水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病原的快速、準(zhǔn)確檢測方法和水產(chǎn)動物疾病的快速診斷技術(shù)不僅能直接用于水產(chǎn)動物病害的有效防治，還將為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展奠定良好基礎(chǔ)。

　　由于傳統(tǒng)的病原檢測方法存在靈敏度低、特異性差、費(fèi)時(shí)費(fèi)工等缺點(diǎn)，已不適應(yīng)當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及時(shí)控制病害的要求。因此，利用現(xiàn)代檢測方法和技術(shù)研究開發(fā)靈敏度高、特異性強(qiáng)的魚類疾病快速檢測方法十分必要。近年來，隨著免疫學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，魚類病害的檢測技術(shù)已經(jīng)有了長足的進(jìn)步。在今后的工作中，研究特異性強(qiáng)、敏感性高、方便、快速的魚病診斷技術(shù)，是水產(chǎn)科研工作者一致的目標(biāo)。

　　1、免疫學(xué)技術(shù)

　　免疫學(xué)技術(shù)是利用抗原和抗體之間的特異性反應(yīng)，檢測病原微生物，該方法已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室常用的檢測技術(shù)。目前，用于魚類疾病診斷的免疫學(xué)技術(shù)主要有單克隆抗體技術(shù)、凝集反應(yīng)技術(shù)、熒光抗體技術(shù)、酶免疫技術(shù)、膠體金技術(shù)等。

　　單克隆抗體技術(shù)是利用單抗的特異性、均一性、高效性來進(jìn)行疾病的診斷，該技術(shù)具有快速、簡單、靈敏度高的特點(diǎn)，但單克隆抗體的制備方法還有待改進(jìn)。2013年，賈鵬等制備了抗傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV)單克隆抗體6G7，該抗體效價(jià)高、靈敏度高，特異性強(qiáng)，與天然抗原親和力強(qiáng)忙，可用于傳染性造血器官壞死病毒的快速診斷。

　　凝集反應(yīng)技術(shù)主要用于病原微生物的分型和鑒定，具有特異，快速，設(shè)備簡單，適用于基層的特點(diǎn)。

　　熒光抗體技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)，該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，敏感度高，但對儀器設(shè)備要求過高。鄢慶枇等在2006年應(yīng)用熒光抗體技術(shù)檢測牙鲆體內(nèi)的弧菌。

　　酶免疫技術(shù)的方法很多，用于水產(chǎn)動物疾病診斷的主要是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)技術(shù)和斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Dot-ELISA)技術(shù)。該方法具有操作簡便，靈敏度高，儀器簡單，可定量的優(yōu)點(diǎn)。戰(zhàn)文斌等在2014年發(fā)明了一種雙抗體夾心ELISA檢測對蝦白斑癥病毒的檢測方法；吳志新等在2009年發(fā)明了柱狀黃桿菌的Dot-ELISA檢測方法。

　　膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。運(yùn)用較多的是膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)和快速斑點(diǎn)免疫金滲濾技術(shù)(DIGFA)。孟小林等在2007用免疫膠體金結(jié)合免疫層析法研制了一種快速檢測對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)的試劑條，并申請了專利。

　　2、分子生物學(xué)技術(shù)

　　分子生物學(xué)技術(shù)是以病原核酸為研究對象，通過對病原的核酸進(jìn)行鑒定來證實(shí)病原。近年來，利用分子生物學(xué)技術(shù)對各種病原進(jìn)行檢測發(fā)展非常迅速。用于魚類疾病診斷的分子生物學(xué)技術(shù)有核酸雜交技術(shù)、PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)、LAMP（環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增）技術(shù)、限制性酶酶切檢測技術(shù)、16S rRNA檢測技術(shù)和基因芯片技術(shù)。

　　核酸雜交技術(shù)是利用特異性標(biāo)記的DNA或RNA作為指示探針，使其與病原核酸中互補(bǔ)的靶核苷酸序列進(jìn)行雜交，從而確定宿主是否攜帶某種病原體。該方法已經(jīng)在多種水產(chǎn)動物病原體的檢測中應(yīng)用。雷質(zhì)文等在2001年用PCR法制備了DIG標(biāo)記的探針，建立了斑點(diǎn)雜交檢測WSSV的方法；外國科研工作者在1991年研制了生物素標(biāo)記的反意義探針檢測IHNV，該探針只能和IHNV反應(yīng)并且可以識別所有的IHNV毒株。

　　PCR技術(shù)是通過酶促反應(yīng)合成特異性DNA片段的方法，其用于疾病診斷是基于擴(kuò)增病原的特異性DNA片段。近年來，PCR技術(shù)已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行魚病診斷的常規(guī)技術(shù)，用于疾病診斷及其衍生來的PCR技術(shù)有常規(guī)PCR、套式PCR、多重PCR、免疫PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR。張輝等在2012年建立了草魚出血病病毒的RT-PCR檢測方法；徐進(jìn)等在2013年建立了鯉皰疹病毒2型的套式PCR檢測方法；張德鋒等在2014年建立了同時(shí)能檢測嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和鮰愛德華氏菌的多重PCR檢測方法，可用于水生動物敗血癥的快速診斷；劉箐等在2014年建立了副溶血弧菌的免疫PCR檢測方法，其靈敏度可達(dá)到103~104cfu/mL；劉春等在2014年建立了雜交鱧彈狀病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，最低可以檢測到10個(gè)病毒核酸分子拷貝。

　　LAMP技術(shù)是一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，其反應(yīng)速度快、操作簡單，產(chǎn)物檢測方便，已被用來進(jìn)行魚類疾病的診斷。張金鳳等在2013年建立了逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP) 檢測草魚出血病病毒的方法，最低檢測限為33pg，比PCR方法靈敏度高10倍。廣州迪澳生物科技有限公司的李紅梅等在2013年建立白斑綜合癥病毒的LAMP檢測方法及其檢測試劑盒，并申請了專利，該試劑盒操作簡單，適合現(xiàn)場檢測，特異性強(qiáng)，靈敏度高，可達(dá)1fg/μL。

　　限制性酶可識別DNA上較短的序列，在識別位點(diǎn)上切開DNA，單個(gè)核苷酸變化即可導(dǎo)致限制性酶切位點(diǎn)的增加或缺失。因此，酶切后產(chǎn)生的片段數(shù)目發(fā)生了改變，即所謂的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)。根據(jù)酶切后的DNA片段在凝膠電泳上進(jìn)行分離，染色后即可觀察各個(gè)不同大小的片段，進(jìn)行遺傳變異的分析。

　　16S rRNA檢測技術(shù)是基于生物體的16S rRNA的保守性和差異性建立的一種鑒定病原菌的標(biāo)準(zhǔn)方法，主要用于病原細(xì)菌的鑒定、分類。

　　基因芯片技術(shù)是將大量探針分子固定于支持物上，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原理，與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號的強(qiáng)度及分布進(jìn)而獲取樣品中靶分子的數(shù)量和序列信息�；�因芯片技術(shù)用于魚類疾病的檢測，國內(nèi)外都還處于起步階段，僅用于診斷一些主要的細(xì)菌病和病毒病。