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本方法規(guī)定了食品中亞硝酸鹽的快速檢測(cè)方法。
本方法適用于肉及肉制品（餐飲食品）中亞硝酸鹽的快速測(cè)定。
2 原理
樣品中的亞硝酸鹽經(jīng)提取后，在弱酸性條件下與對(duì)氨基苯磺酸重氮化后，再與鹽酸萘乙二胺反應(yīng)生成紫紅色偶氮化合物，其顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與亞硝酸鹽含量成正相關(guān)，通過(guò)色階卡進(jìn)行目視比色，對(duì)樣品中亞硝酸鹽進(jìn)行定性判定。
3 試劑和材料
除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。
3.1 試劑
3.1.1 對(duì)氨基苯磺酸。
3.1.2 鹽酸萘乙二胺。
3.1.3 鹽酸。
3.1.4 鹽酸（20%）：量取20mL鹽酸，用水稀釋至100mL。
3.1.5 對(duì)氨基苯磺酸溶液（4g/L）：稱取0.4g對(duì)氨基苯磺酸，溶于100mL20%鹽酸中，混勻，置棕色瓶中，臨用新制。
3.1.6 鹽酸萘乙二胺溶液（2g/L）：稱取0.2g鹽酸萘乙二胺，溶解于100mL水中，混勻，置棕色瓶中，臨用新制。
3.2 參考物質(zhì)
亞硝酸鈉參考物質(zhì)中文名稱、英文名稱、CAS號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量見(jiàn)表1，純度≥99%。
表1 亞硝酸鈉中文名稱、英文名稱、CAS登記號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量
中文名稱
英文名稱
CAS登錄號(hào)
分子式
相對(duì)分子質(zhì)量
亞硝酸鈉
Sodiumnitrite
7632-00-0
NaNO2
69.00
3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)工作液（200μg/mL，以亞硝酸鈉計(jì)）：精密稱取適量經(jīng)110℃—120℃干燥恒重的亞硝酸鈉參考物質(zhì)（3.2），加水溶解，移入250mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。
3.4 材料
亞硝酸鹽快速檢測(cè)試劑盒：適用基質(zhì)為肉及肉制品，需在陰涼、干燥、避光條件下保存。
4 儀器和設(shè)備
4.1 移液器：200μL，1mL。
4.2 渦旋混合器或超聲儀。
4.3 電子天平或手持式天平：感量為0.01g和0.0001g。
4.4 離心機(jī)。
4.5 微孔濾膜：0.45μm（水系）。
5 分析步驟
5.1 試樣制備
取適量有代表性樣品的可食部分，充分粉碎混勻。
5.2 試樣的提取
準(zhǔn)確稱取試樣1g（精確至0.01g），置于離心管中，準(zhǔn)確加水10mL，超聲或渦旋振蕩提取5min，靜置10min。準(zhǔn)確吸取1mL上清液（如樣品渾濁，≥3000r/min離心5min取上清液，或經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后取續(xù)濾液）于檢測(cè)管中，向檢測(cè)管中滴加對(duì)氨基苯磺酸溶液200μL，混勻靜置1min，再加入鹽酸萘乙二胺溶液100μL，混勻靜置5min，即得待測(cè)液。
5.3 測(cè)定步驟
將待測(cè)液與標(biāo)準(zhǔn)色階卡目視比色，10min內(nèi)判讀結(jié)果。進(jìn)行平行試驗(yàn)，兩次測(cè)定結(jié)果應(yīng)一致，即顯色結(jié)果無(wú)肉眼可辨識(shí)差異。
5.4 質(zhì)控試驗(yàn)
每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和質(zhì)控樣品試驗(yàn)（或加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)）。用色階卡和質(zhì)控試驗(yàn)同時(shí)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行控制。
5.4.1 空白試驗(yàn)
稱取空白樣品，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。
5.4.2 質(zhì)控樣品試驗(yàn)（或加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)）
亞硝酸鹽質(zhì)控樣品：采用典型樣品基質(zhì)或相似樣品基質(zhì)按照實(shí)際生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的，含有一定量亞硝酸鹽，并可穩(wěn)定保存的樣品。經(jīng)參比方法確認(rèn)的質(zhì)控樣品中亞硝酸鹽含量（以亞硝酸鈉計(jì)）應(yīng)包括但不限于10mg/kg。
加標(biāo)質(zhì)控樣品：準(zhǔn)確稱取空白試樣1g（精確至0.01g），置于離心管中，加入適量亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)工作液（200μg/mL）（3.3）使樣品中亞硝酸鈉含量為10mg/kg。
質(zhì)控樣品（或加標(biāo)質(zhì)控樣品）按5.2和5.3步驟與樣品同法操作。
6 結(jié)果判定要求
觀察檢測(cè)管中樣液顏色，與標(biāo)準(zhǔn)色階卡比較判讀樣品中亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計(jì)）的含量。顏色淺于檢出限（1mg/kg）則為陰性樣品；顏色深于10mg/kg則為陽(yáng)性樣品。色階卡見(jiàn)圖1。
注：1.顏色接近或深于1mg/kg，但淺于或接近10mg/kg時(shí)，則考慮本底污染或帶入所
2.10mg/kg僅作為本方法的本底控制限。
圖片
圖1 亞硝酸鹽色階卡
質(zhì)控試驗(yàn)要求：空白試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陰性，質(zhì)控樣品試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)在其標(biāo)示量值允差范圍內(nèi)，加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)與加標(biāo)量相符。
7 結(jié)論
由于色階卡目視判讀存在一定誤差，為盡量避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果，讀數(shù)時(shí)遵循就高不就低的原則。當(dāng)測(cè)定結(jié)果大于10mg/kg時(shí)，應(yīng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行確證。
8 性能指標(biāo)
8.1 檢測(cè)限：1mg/kg。
8.2 靈敏度：靈敏度應(yīng)≥99%
8.3 特異性：特異性應(yīng)≥85%。
8.4 假陰性率：假陰性率應(yīng)≤1%。
8.5 假陽(yáng)性率：假陽(yáng)性率應(yīng)≤15%。
注：性能指標(biāo)計(jì)算方法見(jiàn)附錄A。
9 其他
本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時(shí)不作限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對(duì)其進(jìn)行考察，應(yīng)滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)。
本方法參比方法為GB 5009.33-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定—第二法分光光度法》。
待測(cè)樣品中若存在高含量的亞硫酸氫鈉、抗壞血酸或醬油時(shí)，會(huì)對(duì)本法的顯色結(jié)果產(chǎn)生一定影響，檢測(cè)時(shí)應(yīng)予以注意。
色階卡應(yīng)確保在試劑盒保質(zhì)期內(nèi)不出現(xiàn)褪色或變色的情況。
附錄A
快速檢測(cè)方法性能指標(biāo)計(jì)算表
表A.1 性能指標(biāo)計(jì)算表
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樣品情況a |
檢測(cè)結(jié)果b |
總數(shù) |
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陽(yáng)性 |
陰性 |
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陽(yáng)性c |
N11 |
N12 |
N1.=N11+N12 |
|
陰性 |
N21 |
N22 |
N2.=N21+N22 |
|
總數(shù) |
N.1=N11+N12 |
N.2=N21+N22 |
N=N1.+N2.或N.1+N.2 |
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顯著性差異(х2) |
c2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21), 自由度（df）=1 |
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靈敏度(p+，%) |
p+=N11/N1. |
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特異性(p-，%) |
p-=N22/N2. |
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假陰性率(pf-，%) |
pf-=N12/N1.=100-靈敏度 |
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假陽(yáng)性率(pf+，%) |
pf+=N21/N2.=100-特異性 |
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相對(duì)準(zhǔn)確度，%d |
(N11+N22)/(N1.+N2.) |
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注： a由參比方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果或者樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果； b由待確認(rèn)方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。用于確認(rèn)方法時(shí)，結(jié)果≥1mg/kg時(shí)，判定為陽(yáng)性（僅用于計(jì)算性能指標(biāo)）； c本方法規(guī)定：用于計(jì)算靈敏度和假陰性率的陽(yáng)性樣品，由參比方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果范圍應(yīng)在1—10mg/kg之間。 N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個(gè)下標(biāo)指行，第二個(gè)下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。 d為方法的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確性的結(jié)果，與一致性分析和濃度檢測(cè)趨勢(shì)情況綜合評(píng)價(jià)。 |
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