對比內容

中國藥典

美國藥典

歐洲藥典

依據(jù)

通則2351真菌毒素測定法

GENERAL CHAPTERS<561>

ARTICLES OF BOTANICAL ORIGIN

2.8.18 DETERMINATION OF AFLATOXIN B1 IN HERBAL DRUGS

方法

第一法

HPLC法

TLC法

HPLC法

第二法

HPLC-MS法

薄層掃描法

第三法

酶聯(lián)免疫法

HPLC法

限度

每1000g含黃曲霉毒素B1不得過5μg ，總量不得過 10μg。

每1000g含黃曲霉毒素B1不得過5μg，總量不得過20μg。

每1000g含黃曲霉毒素B1不得過2μg，總量不得過4μg。

說明

中國藥典的三種方法都可以使用，當測定結果超出限度時，采用第二法進行確認。

首先使用第一法，第一法系統(tǒng)適用性不通過才會使用第二法或第三法。

只有一種方法，適用于devil’s claw root, ginger and senna   pods，用于其他品種需要驗證適用性。

檢驗方法

具體內容

色譜柱

十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑

流動相

甲醇-乙腈-水(40 : 18 : 42)

流速

1.0ml/min

柱后衍生化

光化學衍生器（254nm）

檢測器

熒光檢測器，激發(fā)波長360nm (或365nm)，發(fā)射波長450nm。

系統(tǒng)適用性

兩個相鄰色譜峰的分離度應大于1.5；需確認回收率應在60~120%，線性回歸的相關系數(shù)應不低于0.990；

混合對照品溶液

精密量取黃曲霉毒素混合對照品溶液（黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2 標示濃度分別為 1.0μg/ml、0. 3μg/ml、l.0μg/ml、0.3μg/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為貯備溶液。精密量取貯備溶液l ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。

供試品溶液

取供試品粉末約15g（過二號篩），精密稱定，置于均質瓶中，加入氯化鈉3g，精密加入70%甲醇溶液75ml, 高速攪拌2 分鐘（攪拌速度大于11000 r/min），離心 5 分鐘（離心速度4000r/min），精密量取上清液15ml, 置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，離心 10分鐘（離心速度4000r/min)，精密量取上清液20ml，通過免疫親合柱，流速每分鐘3ml, 用水20ml洗脫(必要時可以先用淋洗緩沖液10ml洗脫，再用水10ml洗脫），棄去洗脫液，使空氣進人柱子，將水擠出柱子，再用適量甲醇洗脫, 收集洗脫液，置 2ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0. 22μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

進樣量

混合對照品溶液5μ1、10μ1、15μ1、20μ1、25μ1；供試品溶液20~50μl。

定量方法

測定各對照品溶液的峰面積，以峰面積為縱坐標，以進樣量為橫坐標，繪制標準曲線；測定供試品溶液的峰面積，從標準曲線上讀出供試品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，并計算出四者總和。

檢驗方法

具體內容

色譜柱

4.6-mm×15   cm，3-μm填料L1（即十八烷基硅烷鍵合硅膠）

流動相

水-甲醇-乙腈（60:25:15）

流速

0.8   mL/min

檢測器

熒光檢測器，激發(fā)波長362nm，發(fā)射波長440nm

系統(tǒng)適用性

洗脫順序為AFG2、AFG1、AFB2和AFB1；

將5號線性對照溶液5ml加入到5g的樣品中，按“供試品溶液”（甲醇-0.5%碳酸氫鈉（7:3）用量為20ml）處理方法，計算AFB1（2μg/kg）和黃曲霉毒素（5μg/kg）的平均回收率，應分別不低于68%和70%。AFB1和黃曲霉毒素總量的相對標準偏差（RSD）不高于10%。

免疫親和柱預處理

免疫黃曲霉素柱的總黃曲霉毒素最小容量不低于100ng。將AFB1、AFB2、AFG1和AFG2每個5ng，溶于10mL 10%甲醇的磷酸鹽緩沖鹽溶液（v/v）中時，各回收率不低于80%。

對照品溶液

用乙腈制備AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分別含有2.0、0.50、2.0和0.50μg/ml的混合對照溶液。首先用乙腈制備標示濃度均為10μg/ml的各儲備液，在360nm附近測定最大吸光度，計算公式為：黃曲霉毒素濃度（μg/ml）=（A×Mr×1000）/ε，其中A為吸光度，Mr為分子量，ε為摩爾吸收系數(shù)，見附表1。準確量取一定量黃曲霉毒素各儲備液至同一容量瓶，用乙腈稀釋至規(guī)定濃度。冰箱儲存，使用前平衡至室溫。用甲醇-水（1:1）稀釋黃曲霉素對照溶液，最終濃度見附表2。冰箱保存，使用前平衡至室溫，每日新制。

供試品溶液

取樣品5g，置于50ml離心管中，加入氯化鈉1 g和甲醇-0.5%碳酸氫鈉（7:3）25 mL。在渦流混合器上混合，直到樣品顆粒和提取溶劑充分混合，400 rpm振搖10min，7000 rpm離心10min，立即取7 mL至50 mL離心管中，加入0.1 M磷酸鹽緩沖溶液28 mL，混合，過濾，收集25ml濾液（相當于1g樣品）到25ml刻度量筒中，并立即上IAC柱。[注：對于IAC柱在使用前必須在室溫下至少平衡15分鐘。]從小柱上取下頂蓋，并將其與儲液罐連接。從柱上拆下端蓋，并將其連接到柱歧管上（必須擰緊）。讓柱中的液體通過，直到液體高出柱床約2~3 mm。將濾液25ml倒入儲液罐。讓液體自然流過柱子，讓柱子流干。為了便于再次開始流動，從歧管上取下色譜柱，向柱中加入磷酸鹽緩沖鹽溶液約2 mL，將色譜柱重新連接到儲液罐上，然后用磷酸鹽緩沖鹽溶液3ml和水5ml清洗色譜柱（如果使用其他技術去除柱末端的氣泡并很容易重新開始流動，則可將磷酸鹽緩沖鹽溶液5ml直接加入到柱儲液罐中）。讓柱子流干，然后用注射器注入3ml空氣通過柱子，用甲醇1ml洗脫，并用3ml容量瓶中收集洗脫液，使洗脫液自由滴落。讓柱子流干。靜置1分鐘，然后用額外的甲醇1ml洗脫，并收集在同一容量瓶中。讓柱子流干，并注入10ml空氣通過柱子，用水稀釋洗脫液至刻度，立即進行分析。

進樣量

50μ1

定量方法

毒素（μg/kg）={[（R−a）/S]×V/W}×F

R=樣品溶液的峰面積；a=校準曲線的y截距；S=校準曲線的斜率；V=樣品溶液的最終體積（mL）；W=通過免疫柱的供試品1g；F=稀釋系數(shù)，V=3 mL時為1；黃曲霉毒素的總量是AFG1、AFG2、AFB1和AFB2的總和。

檢驗方法

具體內容

色譜柱

柱長0.25m，直徑4.6mm，十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相（5-μm）

流動相

乙腈-甲醇-水(2:3:6)

流速

1.0ml/min

柱后衍生化

光化學衍生器（254nm）

檢測器

熒光檢測器檢測，激發(fā)波長= 365nm，發(fā)射波長Aem =435nm。

系統(tǒng)適用性

出峰順序：G2、G1、B2、B1；需滿足驗證要求。

對照品溶液

用甲苯-乙腈(98:2)制備10μg/mLAFB1貯備溶液，并在330nm~370nm波長范圍內測定吸收曲線，計算公式為：黃曲霉毒素濃度（μg/mL）=（A×M×100）/ε，其中A為紫外吸收曲線上的最大吸光度，M為B1的分子量（312g/mol），ε為摩爾吸收系數(shù)（1930m2/mol）。用甲苯-乙腈(98:2)將初級貯備液稀釋為100ng/mL的次級貯備液，用鋁箔緊密包好后，置于4℃儲存，使用前，待溶液恢復至室溫后才能取下鋁箔。使用前后記錄容量瓶的重量。按附表3制備系列對照溶液，將所需體積的次級貯備液置于250ml容量瓶中，氮氣吹干，加入甲醇75ml溶解黃曲霉毒素B1，并用水稀釋至刻度。

免疫親和柱預處理

免疫親和柱對黃曲霉毒素B1的容量不低于100 ng。將AFB1 5 ng，溶于12.5ml甲醇和87.5 mL 水中時，回收率不低于80%。使用前平衡至室溫。

供試品溶液

取本品粉末5.00g，加入甲醇:水(70:30)混合溶液100ml，超聲處理30min，取濾液10ml至150ml錐形瓶，并加入水70ml。取40ml以流速3ml/min（不得超過5ml/min）通過免疫親和柱。用水以流速5ml/min沖洗小柱兩次，每次10ml.用注射器注入空氣10s。取甲醇5ml注入小柱，并保持自然流出，收集洗脫液至5ml容量瓶中，1min后，注入甲醇0.5ml ，再隔1min后，注入甲醇0.5ml，每次加入甲醇后，均通過注入空氣收集洗脫液，用水稀釋至容量瓶刻度，搖勻。溶液澄清的話，可直接用于分析；否則應過濾處理，并確保黃曲霉毒素沒有損失。

進樣量

500μ1

定量方法

用黃曲霉毒素B1系列對照溶液1~5做標準曲線，樣品濃度超出線性范圍，則需要做相應稀釋。

毒素（μg/kg）=[（R−b）/a]×V /W

R=樣品溶液的峰面積；b=校準曲線的截距；a=校準曲線的斜率；V稀釋倍數(shù)；W=通過免疫柱的供試品g；黃曲霉毒素的總量是AFG1、AFG2、AFB1和AFB2的總和。

黃曲霉毒素

M

溶劑

ε

AFB1

312

乙腈

20700

AFB2

314

乙腈

22500

AFG1

328

乙腈

17600

AFG2

33

乙腈

18900

序號

黃曲霉素對照溶液加入量(μl)

黃曲霉素工作對照溶液（ng/ml）

AFB1

AFB2

AFG1

AFG2

總和

1

0

0

0

0

0

0

2

12.5

0.25

0.0625

0.25

0.0625

0.625

3

25

0.5

0.125

0.5

0.125

1.25

4

50

1

0.25

1

0.25

2.5

5

100

2

0.5

2

0.5

5

6

200

4

1

4

1

10

系列對照溶液

加入次級貯備液的體積(μl)

對照溶液的最終濃度(ng/ml)

1

125

0.05

2

250

0.1

3

500

0.2

4

750

0.3

5

1000

0.4