12個經(jīng)典問題,一起來看看吧!
1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的做法依據(jù)?
GB/T22554-2010《基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性校準(zhǔn)》中:
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍應(yīng)覆蓋正常操作條件下的被測量范圍;
2、標(biāo)準(zhǔn)樣品的組分盡量與被測樣品組分一致;
3、標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度值應(yīng)等距離的分布在被測量范圍;
4、標(biāo)準(zhǔn)樣品的個數(shù)至少應(yīng)有3個濃度;
5、每個標(biāo)準(zhǔn)點至少重復(fù)2次,這個重復(fù)是指從稀釋開始;
如果國家標(biāo)準(zhǔn)有相應(yīng)的濃度系列推薦,盡量按國家標(biāo)準(zhǔn)。工作中我們經(jīng)常采用線性校準(zhǔn),因為線性方程最為簡潔。
2.什么是校準(zhǔn)曲線?
校準(zhǔn)曲線包括標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線,前者用標(biāo)準(zhǔn)溶液系列直接測量,沒有經(jīng)過預(yù)處理過程,這對于樣品往往造成較大誤差;而后者所使用的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)過了與樣品相同的消解、凈化、測量等全過程。
3.首先標(biāo)曲要做幾個點?
標(biāo)準(zhǔn)曲線需要幾個數(shù)據(jù)點,是由所檢測組分的濃度范圍、分析儀響應(yīng)特性、干擾因素、濃度與檢測信號響應(yīng)類型有關(guān)的。
3個點:對于一些低濃度,特別是微量分析,并且濃度范圍不是很大的,檢測器響應(yīng)可靠,背景干擾非常小的,則可以選用較少的工作點就行,一般有3個濃度點就足夠了,有些甚至可以只用一個濃度點就行,另一個點直接用坐標(biāo)原點。
4~6 個點:對于平時測量的樣品濃度范圍較寬,并且檢測器響應(yīng)不完全是一次曲線(直線)的,可以采用二次曲線或分段校正方式,以減少數(shù)據(jù)偏差,這種情況就需要多用幾個數(shù)據(jù)點,如果不分段,數(shù)據(jù)點有4~6 個就夠用。
至少兩個點:但如果是分段校正,則每段需要至少兩個數(shù)據(jù)點。而對于一些樣品無濃度范圍規(guī)律的,特別是一些檢測機構(gòu),如果分析儀的檢測響應(yīng)可靠,環(huán)境因素影響少的,可以做校正曲線。若是環(huán)境因素影響大的,則不必做校正曲線,而采用標(biāo)準(zhǔn)加入法或標(biāo)準(zhǔn)加入-一次稀釋法反而簡便一些。
實際上,我們一般是做五個點(不包括零濃度);一般以檢出限的5~10倍為第一個點,以后根據(jù)1倍遞增,最高濃度是最低濃度的10~20倍為宜(理化分析實驗為例)。當(dāng)然,要根據(jù)儀器的靈敏度來調(diào)整。
4.標(biāo)曲R值是幾個9才合格?
實驗室應(yīng)按檢測標(biāo)準(zhǔn)(方法)的要求使用標(biāo)準(zhǔn)溶液或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。所用標(biāo)準(zhǔn)溶液或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)覆蓋被測樣品的濃度范圍。檢測標(biāo)準(zhǔn)(方法)如無具體的要求,至少使用5個標(biāo)樣(除空白外)建立線性標(biāo)準(zhǔn)曲線,每個點重復(fù)測定1-3次,對于篩選方法,線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.98,對于確證方法,相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.99。
其實,大于0.99是判斷是否為線性相關(guān)的一個標(biāo)準(zhǔn),實際應(yīng)用中線性大于0.999才是比較理想的。線性在0.99到0.999之間的監(jiān)測結(jié)果只用接近最高濃度一半(中間濃度)的位置才比較準(zhǔn)確,如果線性大于0.999的話,在整個線性范圍內(nèi)都會有一個比較滿意的結(jié)果。
如果檢測的線性不好,可以減少標(biāo)準(zhǔn)的覆蓋范圍,將標(biāo)準(zhǔn)的濃度調(diào)整到待測樣品濃度附近,這樣結(jié)果也是非常準(zhǔn)確的。例如,樣品的濃度約20ppb,但在0~50ppb范圍建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,但線性非常不理想,這時可以將標(biāo)準(zhǔn)范圍調(diào)整到15~25ppb之間,作五個標(biāo)準(zhǔn)。
5.標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗?
(1)線性檢驗:
即檢驗校準(zhǔn)曲線的精密度。對于以4-6個濃度單位所獲得的測量信號值繪制的校準(zhǔn)曲線,分光光度法一般要求其相關(guān)系數(shù) | r | ≥0.9990,否則應(yīng)找出原因并加以糾正,重新繪制合格的校準(zhǔn)曲線。
(2)截距檢驗:
即檢驗校準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度,在線性檢驗合格的基礎(chǔ)上,對其進行線性回歸,得出回歸方程 y= a+bx ,然后將所得截距a與0作t檢驗,當(dāng)取95%置信水平,經(jīng)檢驗無顯著性差異時,a可做0處理,方程簡化為y= bx,移項得x=y/b。在線性范圍內(nèi),可代替查閱校準(zhǔn)曲線,直接將樣品測量信號值經(jīng)空白校正后,計算出試樣濃度。
當(dāng)a與0有顯著性差異時,表示校準(zhǔn)曲線的回歸方程計算結(jié)果準(zhǔn)確度不高,應(yīng)找出原因予以校正后,重新繪制校準(zhǔn)曲線并經(jīng)線性檢驗合格。在計算回歸方程,經(jīng)截距檢驗合格后投入使用。
回歸方程如不經(jīng)上述檢驗和處理,就直接投入使用,必將給測定結(jié)果引入差值相當(dāng)于解決a的系統(tǒng)誤差。
(3)斜率檢驗:
即檢驗分析方法的靈敏度,方法靈敏度是隨實驗條件的變化而改變的。在完全相同的分析條件下,僅由于操作中的隨機誤差導(dǎo)致的斜率變化不應(yīng)超出一定的允許范圍,此范圍因分析方法的精度不同而異。例如,一般而言,分子吸收分光光度法要求其相對差值小于5%,而原子吸收分光光度法則要求其相對差值小于10%等等。
6.標(biāo)準(zhǔn)曲線有效期的規(guī)定?
(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線屬于實驗室質(zhì)量控制的范圍,按照《實驗室資質(zhì)認定評審準(zhǔn)則》中結(jié)果控制的要求:定期使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(參考物質(zhì))進行監(jiān)控和/或使用次級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(參考物質(zhì))開展內(nèi)部質(zhì)量控制。
(2)準(zhǔn)則中并未對“定期”進行規(guī)定,所以如果“定期”,就根據(jù)實驗室的實際情況來定了。
(3)既然準(zhǔn)則上沒說明,那根據(jù)一般的分析教材,當(dāng)實驗條件(包括藥劑、人員、儀器等)發(fā)生變化時,最好重新制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。一般來說儀器如果長期使用,并經(jīng)過檢定,是處于穩(wěn)定狀態(tài),而人員藥劑的變化往往會較大。如果說每次換個人操作都要換曲線,那工作量就太大了。
7.每次開機都必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線?
從檢測的要求來說,因為:
1、每天所配的流動相都會有所不同,導(dǎo)致出峰的時間都會有一定的差異,峰面積相應(yīng)都有所差異。
2、檢測器光能也在不斷的衰弱,因此其每天的相應(yīng)值也有所不同,其峰面積也有差異。
基于以上原因,原則上應(yīng)該是每天都要進行標(biāo)準(zhǔn)曲線校正的。
標(biāo)準(zhǔn)曲線不要每次都做,但是每次必須進標(biāo)準(zhǔn)品樣品;因為每次你的流動相和原來的不可能完全一樣,同時儀器的狀態(tài)也在變化,所以不同批次間的保留時間是不一致的,所以你必須用隨行標(biāo)準(zhǔn)品來定位與定量。
8.校準(zhǔn)曲線能不能長期使用?
每批樣品應(yīng)測定一個校準(zhǔn)曲線中間點濃度的標(biāo)準(zhǔn)液,其測定濃度與校準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)點的濃度相對誤差不得超過規(guī)定范圍,如果超過規(guī)定相對誤差,需重新繪制校準(zhǔn)曲線。
也可以這樣說,不同的分析項目,不同的分析方法,校準(zhǔn)曲線斜率的穩(wěn)定性不同。如校準(zhǔn)曲線的斜率較為穩(wěn)定,則在樣品分析時,可只測定兩個標(biāo)準(zhǔn)點,當(dāng)此兩個標(biāo)準(zhǔn)點與原曲線相應(yīng)點的相對偏差均小于5%時,可使用原校準(zhǔn)曲線。因此,樣品分析前,需根據(jù)斜率的穩(wěn)定性來確定是否需同時制作校準(zhǔn)曲線。
我們一般的做法是,根據(jù)檢測的頻率來做,如果該項目天天都要檢測,并且檢測量較多時,要求至少每周做一次曲線。如果檢測量上,一個月都沒有幾單的話,就一個月做一次曲線。當(dāng)然,儀器如果出現(xiàn)故障并大修后回來的,經(jīng)過檢定后,需要重新做曲線。
9.標(biāo)準(zhǔn)曲線是否必須過原點?
標(biāo)準(zhǔn)曲線不一定非要過原點,只要線性好就可以了。因為做空白的話基本上不會過原點。過原點是強制過的,實際曲線可能不過,就會造成誤差。不過原點是因為有系統(tǒng)誤差。
針對是否過原點(0,0)問題,我想可以從原點(0,0)代表的意義來考慮:
即所測組分濃度為零的時候,信號響應(yīng)值(液相色譜也就是峰高或者峰面積)是否也為零。通常來說色譜分析是屬于這種情況的,因而可以把(0,0)點作為一個濃度水平計入標(biāo)準(zhǔn)曲線(甚至不需要真的去配一個濃度為零的標(biāo)準(zhǔn)溶液來進樣),這也是單點法定量的一個依據(jù);而類似的情況在光譜法測定時就講不通了,濃度為零的標(biāo)準(zhǔn)溶液(本底)響應(yīng)信號(吸光度)往往不是零,這個時候標(biāo)準(zhǔn)曲線就不一定過原點了。
10.標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍?
線性范圍這個大家都比較清楚,主要從相關(guān)系數(shù)r看,一般要求r大于等于三個九。之前做實驗有時候濃度高時,線性不好,高濃度點不在標(biāo)準(zhǔn)曲線上,而是在標(biāo)準(zhǔn)曲線的下面,而且離擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較遠。遇到這種情況,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)就很差,有時候才一個九,最后我終于想明白了,如果自己用手動擬合的話,用平滑的曲線去連接所有點的話,你就會發(fā)現(xiàn),如果在線性范圍內(nèi),連接起來就是直線,如果超出了線性范圍,連接起來就是一條彎曲的曲線。
11.相關(guān)系數(shù)的有效數(shù)字?
GB5750.3-2006 8.2.7項有如下規(guī)定:校準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)只舍不入,保留到小數(shù)點后出現(xiàn)非9的一位,如0.99989→0.9998。如果小數(shù)點后都是9時,最多保留小數(shù)點后4位。
12.Y=bX和二次曲線的選用?
標(biāo)準(zhǔn)曲線我們通常采用的是Y=a+bX,曲線擬合完必須要做統(tǒng)計檢驗,且要做統(tǒng)計完備的線性檢驗和失擬檢驗,然后再做a與0的差別檢驗,如果a與0的統(tǒng)計學(xué)上無差異,你就可以考慮用Y=bX的擬合曲線,擬合出來后同樣做線性檢驗和失擬檢驗,如果線性檢驗合格(P<0.05)且失擬檢驗合格(P>0.05)此時你就可以采用Y=bX。
二次曲線的采用同樣是這樣的道理,如果你Y=a+bX時擬合不合格,你就考慮用Y=a+bX+cX2,同樣做失擬檢驗,考察擬合的符合情況。如果Y=a+bX 和Y=a+bX+cX2都滿足擬合檢驗和失擬檢驗合格,則采用Y=a+bX形式,這樣符合統(tǒng)計學(xué)上參數(shù)最少的統(tǒng)計簡潔性原則。
標(biāo)準(zhǔn)曲線法有一定的優(yōu)勢,也有一定的缺陷,它特別適合于大量樣品的分析。但由于每次樣品分析的色譜條件(檢測器的響應(yīng)性能,柱溫,流動相流速及組成,進樣量,柱效等)很難完全相同,因此容易出現(xiàn)較大誤差。此外,標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制時,一般使用欲測組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品(或已知準(zhǔn)確含量的樣品),而實際樣品的組成卻千差萬別,因此必將給測量帶來一定的誤差。
了解各個分析項目校準(zhǔn)曲線斜率的穩(wěn)定性及影響穩(wěn)定性的主要因素,可決定是否能采用帶標(biāo)點檢驗原校準(zhǔn)曲線,省略重新制作校準(zhǔn)曲線;從校準(zhǔn)曲線斜率的變化,可判斷標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性,從而確定其標(biāo)定周期;分析低濃度樣品時,應(yīng)使用高純度的水和試劑,以減少空白值,降低樣品的分析誤差。