二、消除非特異性染色的方法

 

消除熒光抗體非特異性染色的方法應(yīng)根據(jù)產(chǎn)生的原因采取適當(dāng)?shù)姆椒�，常用的方法有以下幾種：

 

（一）動物臟器粉末吸收法

 

常用肝粉（豬、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠腦粉和雞胚粉等。每毫升熒光抗體中加入肝粉50~100mg，在離心管中充分混勻，在室溫中振動2h，4℃中過夜，再攪拌10min，高速離心（3000~15000r/min）30min，1~2次后，即可使用其上清液。吸收一般應(yīng)在臨用前進行，吸收后之熒光抗體保存冰箱中勿超過2周。染色應(yīng)作吸收前后之比較，吸收時可先用緩沖鹽水將組織干粉浸濕，離心（3000~15000r/min）30min，除去上清液，再加入熒光抗體進行吸收，以免消耗過多的抗體。

 

肝粉或新鮮細胞吸收是一種非特異性的消除方法，對熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸附作用。如檢查組織中的病毒抗原時，也可用相同的組織干粉或勻漿沉淀物吸收之。

 

用臟器肝粉吸收對熒光抗體損失較多，如果根據(jù)Hiramotos氏等的方法將組織的20%生理鹽水勻漿液，用生理鹽水洗2~3次，12000r/min。

 

10min離心沉淀，用其沉淀物吸收其熒光抗體即能完全達到目的，京極方久氏認為這樣吸收對熒光抗體幾乎沒有損失，他們常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用時有必要再吸收一次。

 

肝粉的制法：

 

（1）將若干只小白鼠或大白鼠放血殺死，取出肝臟，用生理鹽水洗2~3次，除去血液，剝掉表面的結(jié)締組織的脂肪。

 

（2）剪碎，用生理鹽水反復(fù)洗滌至無血色止，然后再加生理鹽水少許，用組織搗碎機或勻漿器作成勻漿。

 

（3）將肝勻漿裝入離心管內(nèi)（1/3左右），交換地用2~3倍量生理鹽水和丙酮反復(fù)洗滌各三次，至上清無血色止，每次完畢先用2000r/min離心沉淀15 min后，再除去上清液。

 

（4）最后用丙酮洗滌肝漿，再用布氏漏斗過濾，或離心沉淀，將沉淀物平鋪在潔凈的玻璃板上，37℃烤干（過夜）。

 

（5）在乳缽中充分研磨，用120目銅篩篩選過后，分裝，密封，低溫干燥保存。

 

（二）透析法

 

熒光素如FITC分子可以通過半透膜，而蛋白質(zhì)大分子不能透過，可將未與蛋白結(jié)合的熒光素透析除去。

 

（1）將標(biāo)記完畢的熒光蛋白液裝入一透析袋或玻璃紙袋內(nèi)，液面稍留空隙，緊扎。

 

（2）浸入0.02mol/pH。

 

7.1~7.4的PBS中（懸于大于標(biāo)記物體積約50~100倍的PBS內(nèi)），在4℃中透析，每日更換3~4次PBS，約5~7天，透析液中無熒即可（在熒光光源照射下）。

 

（三）葡聚糖凝膠G-50柱層析法

 

除游離熒光素可用2×46cm柱層析法，詳細方法參閱第二章。加入熒光抗體15~18ml（按床體積的5%~10%加樣），使其緩慢滲入柱內(nèi)，待即將全部入柱時，加入PBS少許，關(guān)閉下口，停留30~40min ，使游離熒光充分進入細篩孔中，然后再接通洗脫瓶開始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量后，熒光抗體即向下移行，逐漸與存留于上端的游離熒光素之間拉開明顯的界線，隨著大量洗脫液的不斷加入，二者分離距離越來越大，熒光抗體最先流出，分前、中、后三部分收集，測F/P比值，合格者合并，濃縮，分裝。洗脫液用20%磺基水楊酸測定蛋白（發(fā)生沉淀反應(yīng)），繼續(xù)洗脫，游離熒光素則相繼被洗脫下來，至洗脫液中無蛋白和熒光素后，此層析柱即可再用。

 

若用以除去熒光抗體中的游離熒光素和硫酸銨等鹽類，可先在過柱前透析一夜，否則，太濃NH4+，在蛋白未完全洗脫時即出現(xiàn)NH4+，因而影響提純與回收蛋白，一般待洗脫液出現(xiàn)蛋白時，即進行收集，之后出現(xiàn)SO4++（用1%BaCl2檢查發(fā)生白色沉淀）。最后是NH4+，（用納氏試劑檢查呈黃棕色沉淀），待洗脫液無SO4++及NH4+后可再用。

 

如僅用小量熒光抗體，可用1×20cm的柱層析柱，取2g Sephadex G-50裝柱，即可過濾2~3.5ml熒光抗體。

 

（四）DEAE纖維素柱層析法

 

標(biāo)記過多或過少熒光素的抗體分子可用DEAE-纖維素柱層析法除去。方法如下： DEAE-纖維素柱的裝柱，洗脫、再生方法等與提純IgG方法相同。裝柱所需DEAE-纖維素量以干重每克交換20~50mg標(biāo)記蛋白量為宜。常用梯度洗脫法如下：

 

（1）層析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，標(biāo)記物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脫，洗出無色或淡綠色液體，洗脫液量（根據(jù)床體積大小每梯度乘3），然后依下列各種離子強度洗脫液，

 

分別洗脫和收集：

 

0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/L NaCl）……洗脫部分1。

 

0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/L NaCl）……洗脫部分2。

 

0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/L NaCl）……洗脫部分3。

 

將此三部分收集液（每管5ml）分別測定其F/P比值，0.05mol/L NaCl pH7.2PB洗脫液280nm光密度高峰管合并，濃縮保存?zhèn)溆�。因這部分非特異性染色熒光最少，是比較好的熒光抗體。其他兩部分可以廢棄。

 

（2）柱上吸附的過度標(biāo)記蛋白可繼續(xù)增加NaCl的濃度至2.0mol/L洗脫完。

 

經(jīng)過DEAE-纖維素層析后的標(biāo)記抗體，其抗體量一般約損失50%，因此有些要求不太高的抗體，如抗細菌熒光抗體，不一定要這樣處理，可用染色效價測定的稀釋法除去非特異性染色。

 （五）熒光抗體稀釋法

 

先測定熒光抗體特異性染色與非特異性染色的效價，若二者效價相差較大，則可將熒光抗體稀釋至一臨界濃度，使特異性染色呈陽性，而使非特異性染色保持陰性，稀釋方法和染色效價測定方法相同。

 

（六）純化抗原法

 

用各種方法提純單一成分的抗原是產(chǎn)生單價特異性抗體的最主要條件。近代免疫化學(xué)技術(shù)（免疫吸收法）和柱層析法等提供了很大的可能性，可參考有關(guān)專著。

 

（七）純化抗體法——免疫吸收法

 

例如抗IgA血清的純化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（SIgA）抗原純度不高，所制的抗血清常與IgG呈交叉反應(yīng)，為此需要吸收，常采用純化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收純化。方法如下：

 

1、人IgG聚合物的制備    在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/L pH7.0磷酸緩沖溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，邊加邊攪，5min即出現(xiàn)混濁，逐現(xiàn)大塊膠塊，放置30min后，用研缽將凝膠磨細，繼用 1.0mol/L pH7.0磷酸緩沖溶液反復(fù)洗滌3次，末次加蒸餾水至20ml，即為人IgG聚合物懸液。

 

2、免疫吸收法    將待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物懸液，置室溫攪拌60min，離心沉淀，上清液即稀釋1倍的純化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。

 

（八）伊文氏藍（Evans blue）襯染法

 

用0.01%伊文氏藍的0.01mol/L pH7.2PBS稀釋熒光抗體，可將背景細胞和組織染色，呈紅色熒光，與特異性黃綠色熒光形成鮮明的對比，減少了非特異性熒光，宜作常規(guī)應(yīng)用。伊文氏藍一 般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀釋至0.01%用以稀釋熒光抗體。

 

此外，還可以用胰酶消化組織切片或用10%牛血清蛋白封閉法等消除非特異性染色，提高特異性染色。

 

參考文獻

 

1.Coons AH,et al. Localization of antigen in tissue cell. II. Improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent an-tibody. J Exp Med,1950;91:1-3.

 

2.Riggs JL, Seiwald RI, Burckhulter J, Powns CM and Metcalf TG. Iosthiocyanate compounds as fluorescent labeling agents for immune serum. Am J Path, 1958; 34:1081~1097.

 

3.Marshall ID Jr, Eveland WC and Smith CW. Superiority of fluorescein isothiocyanate (Riggs)for fluorescent antibody technique with a modi-ification of its application. Proc sec Exper Biol C Med(NP), 1958;98:898~900.

 

4.Goldstein G, Slizys IS and Chase MW. Stuides on fluoresent staining.1. Nonspecific fluorescence with fluorescein - coupled sheep anti-rab-bit globulins. J Exper Med, 1961;114:89~110.

 

5.Nairn RC. Fluorecent protein tracing. E & S Living stone LTD. Edinburgh and . London, Third Edition, 1969136~142, PP152~264.

 

6.王伯沄，免疫熒光組織化學(xué)和熒光組織化學(xué)技術(shù)，第四軍醫(yī)大學(xué)科技資料增刊，1974；2：5~30。

 

7. Huang SN, et al. Application of immunofluorescent staining on paraffin section improved by trypsin digestion . Lab Invest, 1976; 35:383.

 

8.Gotako Yamad, et al .Hepatitis B core and surface antigens in liver tissue. Lab Invest, 1977;36:649.

 

9.黃 策，免疫熒光和熒光免疫，1983年，全軍三防醫(yī)學(xué)會議報告論文。

 

10. 張忠兵，等。雙標(biāo)記免疫熒光法對胃粘膜抗體產(chǎn)生細胞的對比研究。上海免疫學(xué)雜志，1983；3（5）：304。

 

11.Fairbanks TR. Current status of lymphocyte subpopulation testing in humans. Am J Med Technol, 1980;46:471.

 

12.李元敏等譯，免疫細胞化學(xué)。原子能出版社，1985：25~44。

 

13.Wick G,Traill KN, Schouestein K. Immunofluorescence Technology， Selected Theoretical and Clinical Aspects. Elseries Biomedical Press. Amsterdom, 198227~36, P181, P219~262, P317~323.

 

14. AKiyoshi Kawamura Jr. Fluorescent antibody . Technique and Their Applications. Second Edition University of Tokyo Press， Tokyo,197710,P79,P141~281.

 

15. Ray MB, et al. Immunofluorescent detection of alphaantitrypsin in paraffin embed allowfullscreen='true'ded liver. J Clin Pathol, 1975;28:717.

 

16. 王伯沄，胰酶消化法提高甲醛固定石蠟切片免疫組織化學(xué)法敏感性方法，第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1982；2：127。

 

17. Aurel F. Labelled antibodies in biology and medicine. Printed in Romania,1978P52-190.

 

18. 王伯沄，免疫熒光技術(shù)：汪美先主編。免疫學(xué)基礎(chǔ)。西安：陜西省科學(xué)技術(shù)出版社，1981：279-295。

 

19. 59175部隊。熒光顯微術(shù)。上�？茖W(xué)技術(shù)情報所，1976：224~288。

 

20. Polak JM and Noorden SV. Immunocytochemistry, PP233~248 Wright, PSG. 1983.

 

21. 李成文�，F(xiàn)代免疫化學(xué)技術(shù)。上海：上�？萍汲霭嫔纾�1992：97~100。