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目的建立甘草苷和甘草酸的HPLC含量測定方法。方法使用KromasiL-C18（4.6mm×200mm，5μm）柱，甘草苷采用乙腈-0.5%醋酸（20:80）為流動相，檢測波長276nm，柱溫為室溫；甘草酸流動相為甲醇-0.2mol·L-1乙酸銨溶液-冰乙酸（67∶32∶1），檢測波長252nm，柱溫為室溫。二者流速均為1.0ml·min-1，采用外標(biāo)法定量測定。結(jié)果甘草苷在2.7～27μg·ml-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r=0.9997）；甘草酸在6～36μg·ml-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r=0.9998）；甘草苷和甘草酸的平均回收率分別為101.4%和101.3%，其RSD值分別為1.18%和1.22%。結(jié)論該方法操作簡便、準(zhǔn)確，線性相關(guān)系數(shù)良好，且穩(wěn)定性和重復(fù)性好，適用于甘草黃酮粗提物及純化物中甘草苷和甘草酸的含量測定。
經(jīng)典的黃酮含量測定方法，是以蘆丁為對照品，采用紫外分光光度法測定［3～5］，但此方法用于甘草黃酮的測定尚有諸多不足之處。甘草黃酮的主要成分甘草苷，是反映甘草黃酮內(nèi)在質(zhì)量的一個重要指標(biāo)［6］。本研究以甘草苷為對照品，采用HPLC法測定甘草黃酮含量的方法，同時研究優(yōu)化以HPLC測定甘草酸含量的方法，以期為甘草有效成分的綜合開發(fā)利用和質(zhì)量監(jiān)控提供新的方法和思路。
1儀器與材料1.1儀器LC-10A高效液相色譜儀（日本島津）；SPD-10A可變紫外檢測器（日本島津）；萬分之一天平（Sartorius）；KQ-250B型超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）。
1.2材料甘草（石河子天德中藥廠）。甘草苷對照品、甘草酸單銨鹽對照品（均購自中國藥品生物制品檢定所）；95%乙醇（A.R）、冰醋酸（A.R）、乙酸胺（A.R）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）。
2方法與結(jié)果2.1色譜分析條件2.1.1甘草苷檢測條件色譜柱為KromasiL-C18（4.6mm×200mm，5μm）；流動相為乙腈-0.5%醋酸（20∶80）；紫外檢測波長：276nm；流速1.0ml·min-1；柱溫為室溫；進(jìn)樣量20μl。理論塔板數(shù)按甘草酸銨峰計算應(yīng)不低于4000。對照品和甘草黃酮粗提物的色譜圖見圖1～2。
2.1.2甘草酸檢測條件色譜柱為KromasiL-C18（4.6mm×200mm，5μm）；流動相為甲醇-0.2mol·L-1乙酸銨溶液-冰醋酸（67∶32∶1）；紫外檢測波長252nm；流速1.0ml·min-1；柱溫為室溫；進(jìn)樣量20μl。理論塔板數(shù)按甘草酸銨峰計算應(yīng)不低于2000。
2.2對照品及供試品溶液的配制2.2.1對照品溶液的配制取甘草苷和甘草酸單銨鹽對照品適量，精密稱定，用流動相配制成濃度為54μg·ml-1的甘草苷對照品溶液和120μg·ml-1的甘草酸單銨鹽對照品溶液。
2.2.2供試品溶液的制備精密稱取甘草黃酮提取物適量，用相應(yīng)的流動相溶解，定溶于10ml量瓶中，作為甘草苷供試品溶液。
精密稱取甘草黃酮提取物適量，用相應(yīng)的流動相溶解，定溶于10ml量瓶中，作為甘草酸供試品溶液。
2.3檢測波長的選擇以流動相為參比溶液，在200～400nm波長范圍內(nèi)分別對甘草苷和甘草酸對照品溶液進(jìn)行掃描，結(jié)果表明，甘草苷在276nm處有一最大吸收峰，甘草酸在252nm處有一最大吸收峰，所以選定276nm為甘草苷的檢測波長，252nm為甘草酸的檢測波長。
2.4線性關(guān)系的考察精密吸取甘草苷對照品儲備液0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00ml于10ml量瓶中，用20%乙腈定容至刻度，搖勻；再精密吸取甘草酸單銨鹽對照品儲備液0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00ml于10ml量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻；分別按“2.1”項色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積A（μV·s）對進(jìn)樣濃度C（μg·ml-1）作回歸統(tǒng)計，結(jié)果：甘草苷在2.7～27μg·ml-1范圍內(nèi)線性良好，回歸方程：A=24962C 7161.1，r=0.9997。
甘草酸在6～36μg·ml-1范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為：A=23653C 23125，r=0.9998。
2.5精密度實驗取同一供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，求得甘草苷的RSD為0.74%，甘草酸的RSD為0.92%，說明本方法精密度良好。
2.6重復(fù)性實驗按“2.2.2”項制備同一批號供試品溶液6份，按擬定的色譜條件分別測定甘草苷和甘草酸的含量，測得甘草苷的RSD為1.32%，甘草酸的RSD為1.04%，表明重復(fù)性較好。
2.7穩(wěn)定性實驗配制同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12，24，36，48h后進(jìn)樣，求得甘草苷的RSD為1.44%，甘草酸的RSD為0.89%，表明樣品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。
2.8回收率實驗取已知含量的同一供試品溶液各5份，分別精密加入同一濃度同一體積的甘草苷對照品溶液，甘草酸單銨鹽對照品溶液，混勻，進(jìn)樣，按上述方法測定甘草酸和甘草苷的含量，測得甘草苷和甘草酸的平均回收率分別為101.4%，101.3%；RSD值分別為1.18%，1.22%。表明本實驗所確定的HPLC法進(jìn)行甘草苷和甘草酸的含量分析，準(zhǔn)確度較高。結(jié)果見表1。表1甘草酸和甘草苷的回收率實驗結(jié)果2.9樣品測定分別精密稱定甘草黃酮粗提物和純化物各3份，適量，按“2.2.2”項方法制備所需的供試品溶液，按“2.1”項的色譜條件分別測定甘草苷和甘草酸的峰面積，計算甘草黃酮粗提物（烘干樣）中甘草苷和甘草酸的純度分別為3.68%和18.38%，甘草黃酮純化物（烘干樣）中甘草苷的純度為17.29%，未檢測到甘草酸。
測定項甘草黃酮粗提物123平均值RSD甘草黃酮純化物123平均值RSD甘草酸純度18.2518.5118.3918.380.71-----甘草苷純度3.623.733.693.681.5117.1617.3117.4017.290.70“-”為未檢測到。
3討論3.1甘草苷流動相的選擇考察了選用不同比例的乙腈-0.5%醋酸為流動相時對甘草苷的保留時間及分離度的影響。實驗結(jié)果表明，以乙腈-0.5%醋酸（10∶90）為流動相時，保留時間短，但峰形較差，乙腈比例增大后峰形變得較尖銳對稱，響應(yīng)值顯著增大，分離度逐漸改善，保留時間先增大后縮短，當(dāng)乙腈比例大于20%后，未檢測到甘草苷，綜合考慮，選用乙腈-0.5%醋酸（20∶80）為流動相，甘草苷的保留時間適中，分離效果好。
3.2甘草酸流動相的選擇本實驗分別選用不同比例的甲醇-2%乙酸，甲醇-0.2mol·L-1乙酸銨溶液-冰醋酸（67∶32∶1）為流動相，實驗結(jié)果表明，甲醇-2%乙酸（73∶27）和甲醇-0.2mol·L-1乙酸銨溶液-冰乙酸（67∶32∶1）為流動相時，分離效果均較好，但在流動相的穩(wěn)定性和分析時間的合理性方面，后者更優(yōu)越，因此選用甲醇-0.2mol·L-1乙酸銨溶液-冰醋酸（67∶32∶1）為流動相。
按本法分別對甘草苷和甘草酸進(jìn)行高效液相色譜分析，具有回收率和線性相關(guān)系數(shù)良好，操作簡便，快速，樣品用量少，精密度和重復(fù)性好，自動化程度高等優(yōu)點，適用于甘草黃酮粗提物及純化物中甘草苷和甘草酸的質(zhì)量控制，具有廣泛的應(yīng)用前景。
