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細菌DNA提取方案:革蘭氏陰性菌,如E.coli,一般有三種可以選擇的方法.
一、水煮模板法——主要用于PCR反應
1、接種單菌落于LB或腦心平板,連續(xù)畫線,37攝氏度培養(yǎng)18－24小時.
2、刮取1～2接種環(huán)菌苔加入150微升三蒸水中,混勻,100攝氏度煮沸10分鐘.
3、12000轉/分鐘離心10分鐘,取上清,－20攝氏度保存?zhèn)溆?
操作最簡便,對試劑條件要求低.缺點是純度不夠高,可能會含有RNA、蛋白等雜質.但是作為一般檢測目的的PCR反應模板已經(jīng)足夠了.
有人稱擴增4kb以下片段都可用此種方法制取模版,編者用此類模板PCR可以擴增到3500bp的片段.
編者建議:此法得到的模版保存時間短,強烈建議每月重新制作一次.
二、CTAB/NaCl 法
1、接種一單菌落于5mlLB中,30℃培養(yǎng)過夜,
2、取1ml種子培養(yǎng)液接入100ml2%LB中,37℃、220r/min培養(yǎng)16小時;
3、5000r/min離心10分鐘,棄去上清.
4、加入10mlTE離心洗滌后,用10mlTE溶解菌體,混勻,-20℃保存?zhèn)溆?
5、取3.5ml菌懸液,加入184μl10%SDS,混勻,加入37μl10mg/ml蛋白酶K,混勻,37℃溫育1小時
6、加入740μl5mol/LNaCl,再加入512μlCTAB/NaCl,混勻,65℃溫育10分鐘.
7、加入等體積的氯仿/異戊醇,混勻,10000r/min離心5分鐘,保留上清.
8、上清中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1),混勻,10000r/min離心5分鐘,保留上清.
9、加入0.6倍的異丙醇,混勻,10000r/min離心5分鐘,收集DNA沉淀,用70%乙醇離心洗滌DNA沉淀.
10、用1mlTE溶解DNA,加入終濃度為20μg/mlRNaseA,4℃保存.
CTAB/NaCl法提取的DNA純度較高,蛋白雜質較少,保存時間長,編者更喜歡把終濃度為20μg/ml RnaseA加在第5步溫育的時候,這樣最后沒有RnaseA污染.每一步操作細致一些,得到的DNA可用于Southern blot.
編者建議:長時間保存DNA可放于-20℃,但要盡量減少反復凍融,否則影響DNA質量.
三、鹽析法
1、1.5ml對數(shù)期菌液
2、12000rpm 30 s
3、200ul裂解液（同CTAB/NaCl法）,37c,1hr
4、66ul 5M NaCL,混勻充分,12000rpm 10min
5、上清用粗槍頭取至新管
6、等體積酚充分混勻,12000rpm 3min,反復抽提至無蛋白層
7、取水層,等體積氯仿混勻,12000rpm 3min
8、上清至新管,2倍體積預冷無水乙醇
9、-20C,20min,14000rpm, 15min
10、400ul 70%冷乙醇洗滌
11、干燥,100ul 20ug/ml RNaseA,37C,30min
12、2倍體積無水乙醇沉淀,70%冷乙醇洗滌
13、干燥,溶于100ul TE
介于方法一和方法二之間,CTAB雖然取出糖分效果較好,但CTAB本身也是有毒的,所以此方法放棄了CTAB.
革蘭氏陽性菌,由于細胞壁的結構與陰性菌有差別,裂解比陰性菌稍微麻煩一些,可以采取CTAB/NaCl法稍加修改,在第四步加入終濃度2mg/ml的溶菌酶,37度溫育1h.
實驗注意:提基因組最好要將槍頭尖剪掉（剪掉以后在酒精燈上迅速過一下,使其斷口圓滑）.以免槍頭損傷基因組!抽干時最好是風干!
較精細的實驗,如Southern,強烈推薦用試劑盒!
