1.1 了解厭氧微生物的生長特性

1.2 觀察厭氧微生物(雙歧桿菌)的形態(tài)特征

1.3 掌握厭氧微生物的滾管分離、培養(yǎng)與計數(shù)技術(shù)

 

2 原理

    目前培養(yǎng)厭氧微生物的簡便而又有效的技術(shù)包括有:厭氧箱培養(yǎng)技術(shù);厭氧罐培養(yǎng)技術(shù);厭氧袋培養(yǎng)技術(shù);亨蓋特厭氧滾管技術(shù).這里介紹的是亨蓋特厭氧滾管技術(shù).

    亨蓋特厭氧滾管技術(shù)是美國微生物學家亨蓋特(Hungate)于1950年首次提出并應用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養(yǎng)技術(shù).以后這項技術(shù)又經(jīng)歷了幾十年的不斷改進,從而使亨蓋特厭氧技術(shù)日趣完善,并逐漸發(fā)展成為研究厭氧微生物的一整套完整技術(shù).而且多年來的實踐已經(jīng)證明它是研究嚴格、專性厭氧菌的一種極為有效的技術(shù).

    亨蓋特厭氧滾管培養(yǎng)技術(shù)不僅可用于有益厭氧菌如雙歧桿菌等的分離、與活菌培養(yǎng)計數(shù),還可以用于有害腐敗菌(如酪酸菌)或病原菌(如肉毒梭狀芽孢桿菌)的分離與鑒定.

 

3 材料

3.1 樣品

    雙歧酸奶(液體)、雙歧桿菌制劑(固體).

3.2 培養(yǎng)基

    改良MRS培養(yǎng)基,PTYG培養(yǎng)基.

3.3 儀器和器具

    亨蓋特厭氧滾管裝置一套,厭氧管,厭氧瓶,滾管機,定量加樣器 

 

4 流程

    銅柱除氧→預還原培養(yǎng)基→稀釋用液制備→稀釋樣品→滾管→培養(yǎng)→計數(shù)

 

5 方法

5.1銅柱系統(tǒng)除氧

    銅柱是一個內(nèi)部裝有銅絲或銅屑的硬質(zhì)玻璃管.此管的大小為40—400mm,兩段被加工成漏斗裝,外壁繞有加熱帶,并與變壓器相連來控制電壓和穩(wěn)定銅柱的溫度.銅柱兩端連接膠管,一端連接氣鋼瓶,一端連接出氣管口.由于從氣鋼瓶出來的氣體如N2、CO2和H2等通常都含有O2,故當這些氣體通過溫度約360℃的銅柱時,銅和氣體中的微量O2化合生成CuO,銅柱則由明亮的黃色變?yōu)楹谏?當向氧化狀的銅柱通入H2時,H2與CuO中的氧就結(jié)合形成H2O,而CuO又被還原成了銅,銅柱則又呈現(xiàn)明亮的黃色.此銅柱可以反復使用,并不斷起到除氧的目的.當然H2源也可以由氫氣發(fā)生器產(chǎn)生.

5.2 預還原培養(yǎng)基及稀釋液的制備

    制作預還原培養(yǎng)基及稀釋液時,先將配制好的培養(yǎng)基和稀釋液煮沸驅(qū)氧,而后用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中,一般瓊脂培養(yǎng)基裝4.5-5ml,稀釋液裝9ml,并插入通N2氣的長針頭以排除O2.此時可以清楚地看到培養(yǎng)基內(nèi)加入的氧化還原指示劑—刃天青由藍到紅最后變成無色,說明試管內(nèi)已成為無氧狀態(tài),然后蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋,滅菌備用.

5.3 雙歧桿菌樣品不同稀釋度的制備

    在無菌條件下準確稱取1g固體或用無菌注射器吸取1ml混合均勻的液體樣品,而后加入裝有預還原生理鹽水的厭氧試管中,用震蕩器將其震蕩均勻,制成10-1稀釋液.用無菌注射器吸取1ml 10-1稀釋液至另一支裝有9ml生理鹽水的試管中,制成10-2稀釋液.按此操作方法依次進行10倍系列稀釋至10-7,制成不同濃度的樣品稀釋液.通常選10-5、10-6、10-7三個稀釋度進行滾管培養(yǎng)計數(shù).

5.4厭氧滾管培養(yǎng)法

    將盛有融化的無菌無氧瓊脂培養(yǎng)基試管放置于50℃左右的恒溫水浴中,用1ml無菌注射器分別吸取10-5、10-6、10-7三個稀釋度的稀釋液各0.1ml于融化了的瓊脂培養(yǎng)基試管中,而后將其平放于盛有冰塊的盤中或特制的滾管機上迅速滾動,這樣帶菌的融化培養(yǎng)基在試管內(nèi)壁立即凝固成一薄層.每個稀釋度重復3次,而后置于37℃(酸奶樣品42℃)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).一般培養(yǎng)24—48小時后,即可在厭氧管的瓊脂層內(nèi)或表面長出肉眼可見的菌落.

5.5 雙歧桿菌活菌(分離)計數(shù)

    選擇分散均勻,數(shù)量在幾十~幾百個菌落的厭氧試管進行活菌計數(shù),即可得出每克或每毫升樣品中含有的雙歧桿菌數(shù)量.

5.6 計算

    雙歧桿菌的活菌數(shù)量cfu/g(ml)樣品=0.1ml滾管計數(shù)的實際平均值×10×稀釋倍數(shù)

 

6 結(jié)果

6.1 觀察雙歧桿菌形態(tài),描述其形態(tài)特征. 

6.2 計算每克或每毫升樣品中含有的雙歧桿菌數(shù)量,記錄結(jié)果.

 

7 思考

7.1 比較平板活菌計數(shù)和滾管活菌計數(shù)的異同?

7.2 實驗中通過哪些措施和方法保持細菌的厭氧狀態(tài)?