1.1標(biāo)準(zhǔn)菌株概念

1）GB/T 27405-2008 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品微生物檢測(cè)：

①標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物：標(biāo)準(zhǔn)菌株、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株和工作菌株的統(tǒng)稱。

②標(biāo)準(zhǔn)菌株：至少定義至屬或種水平的菌株。按其特征進(jìn)行分類和描述，有明確的來源。

③標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株：標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)過一代轉(zhuǎn)接后獲得的同種菌株。

④工作菌株：由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備轉(zhuǎn)接后獲得的同種菌株。

1.2標(biāo)準(zhǔn)菌株的應(yīng)用：

各種國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等的相關(guān)微生物檢測(cè)，用于驗(yàn)收培養(yǎng)基(包括試劑盒)、驗(yàn)證方法和評(píng)估實(shí)驗(yàn)操作。

2.1菌株的采集：

實(shí)驗(yàn)室用菌種一是到國(guó)家法定機(jī)構(gòu)采購，二是購買ATCC菌種，三是科研中菌種交流。不管是哪種來源，均統(tǒng)一采集。采集中嚴(yán)格按照規(guī)范執(zhí)行。要求包裝可靠，采集迅速，不泄漏不污染。保證菌種合格和環(huán)境安全。采集中要有菌種傳代標(biāo)識(shí)。選擇有資質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)菌株的合格供應(yīng)商，每批標(biāo)準(zhǔn)菌株必須附帶有供應(yīng)商的合格證或檢測(cè)報(bào)告或說明書，來證明所采購的標(biāo)準(zhǔn)菌株是合格的。

2.2標(biāo)準(zhǔn)菌株和驗(yàn)收

實(shí)驗(yàn)室收到標(biāo)準(zhǔn)菌株，首先應(yīng)進(jìn)行符合性感官檢查，記錄菌株號(hào)和標(biāo)準(zhǔn)菌株來源途徑信息，確保溯源性清楚。同時(shí)還應(yīng)記錄標(biāo)準(zhǔn)菌株名稱和數(shù)量、生產(chǎn)日期、接收日期和有無破損等情況。

2.3凍干標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)活

①開啟產(chǎn)品包裝：先用70%酒精棉擦拭外包裝，從凹口處撕開產(chǎn)品外包裝，撕掉標(biāo)簽上的拉片，將其貼于菌株接收、保存記錄序號(hào)前面。

②復(fù)活：選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件（根據(jù)生產(chǎn)商說明）進(jìn)行復(fù)活。菌種的首次活化最好是在非選擇性瓊脂培養(yǎng)基上，除非特殊情況或特別推薦，一般不用液體培養(yǎng)基。凍干菌株的傳代次數(shù)不得超過5代，從標(biāo)準(zhǔn)菌株保藏中心購買的凍干標(biāo)準(zhǔn)菌株為第F0代。

捏管帽處安瓿瓶（僅一次）使其釋放水合液體。垂直握住安瓿瓶并輕拍之，使液體流入含小球的管底。通過擠捏壓碎小球使其與液體混合，立即將拭子浸于水合液體。擠壓并旋轉(zhuǎn)拭子，接種于初級(jí)培養(yǎng)平板，接種圈的直徑約為25mm，用一無菌接種環(huán)在先前接種區(qū)域劃線10-20次，促使分離出單菌落。同時(shí)吸出部分菌液接種胰蛋白胨大豆肉湯管，副溶血性弧菌接種3%氯化鈉菌胰蛋白胨大豆肉湯管。將接種好的平板和管立即進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)菌培養(yǎng)溫度通常為25℃或37℃。多數(shù)凍干菌株會(huì)在幾天后長(zhǎng)出，但是少數(shù)菌會(huì)表現(xiàn)出延滯期延長(zhǎng)的現(xiàn)象，需要將正常培養(yǎng)時(shí)間加倍。復(fù)活后的菌株為F1代。

③將TSB生長(zhǎng)的濃菌液吸0.5mL于菌株保藏管充分混勻后將液體吸出，將保藏管-18℃保存1-3年為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株F2代。將平板上生長(zhǎng)的良好菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面（副溶血性弧菌用3%氯化鈉營(yíng)養(yǎng)瓊脂）36℃培養(yǎng)24h當(dāng)作工作菌株，記錄為F3代。

2.4工作菌株確認(rèn)方法及依據(jù)

用無菌接種環(huán)取上述培養(yǎng)物，在相應(yīng)的培養(yǎng)基平板（營(yíng)養(yǎng)瓊脂、大豆胰蛋白胨瓊脂）上或相應(yīng)的細(xì)菌鑒別平板（如伊紅美藍(lán)、麥康凱、BP等上劃線分離單個(gè)菌落，置適宜條件下培養(yǎng)（若該類微生物為厭氧菌，則培養(yǎng)條件應(yīng)為厭氧條件）。以同樣方法取真菌和酵母菌至SDA（薩布羅培養(yǎng)基）平板上或玫瑰紅鈉培養(yǎng)基平板上，23～28℃下培養(yǎng)7d；培養(yǎng)后觀察是否具有典型的菌落狀態(tài)，然后挑取單一純菌落，進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，觀察其染色特征及菌體形態(tài)以確定菌種。

2.5 污染處理

假如在該平板上發(fā)現(xiàn)有其他菌落生長(zhǎng)，則說明操作有污染或菌種不純。要將該污染培養(yǎng)物做滅菌處理，尋找原因，重新分離挑選純菌落。

2.6 菌種保存

所有菌種均由實(shí)驗(yàn)室專人(雙人雙鎖)保存于專用冰箱或其它保存方式。要建立菌種登記臺(tái)帳，詳細(xì)記錄菌種采集、保管、制備、使用、處置情況；每一種菌種一定要有檢測(cè)鑒定報(bào)告（具體的的鑒定方法見ATCC提供的菌種證書方法）；

具體菌種保存方法一般為：

將復(fù)蘇后肉湯與滅菌甘油按15%甘油比例（肉湯8.5mL+甘油1.5mL）混合，-30 ℃凍存，（可用2mL凍存管凍存多管），作為保藏儲(chǔ)備菌株F1代，也可使用商品化的菌種保存管。

2.7菌種的傳代

①標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇：

a.菌種操作應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，防止雜菌污染。

b.每次使用和復(fù)蘇時(shí)只需將小珠在平板上滾動(dòng)或置肉湯中培養(yǎng)。

②標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株每轉(zhuǎn)接一次須進(jìn)行確認(rèn)。（確認(rèn)方法一般為他們各自獨(dú)有的形態(tài)，在鑒別培養(yǎng)基上的形態(tài)）

③工作菌株轉(zhuǎn)接的方法：

a.配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（溶血性弧菌加3%氯化鈉 ），121℃高壓滅菌15分鐘后分裝在試管內(nèi)，冷卻后備用。

b.在無菌條件下，用接種環(huán)挑取菌苔至新鮮試管上作“米”字形劃線接種，放置在36℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)。

④工作菌株的使用：

a.內(nèi)部質(zhì)量控制：一個(gè)月一次陽性對(duì)照、培養(yǎng)基每批驗(yàn)收；

b.外部質(zhì)量控制：能力驗(yàn)證、實(shí)驗(yàn)室比對(duì)；

⑤工作菌株的期間核查：

a.期間核查的頻率：每半年對(duì)使用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行一次期間核查。

b.工作菌株期間核查的方法及依據(jù)：同工作菌株的確認(rèn)一樣。

c.建立標(biāo)準(zhǔn)菌株期間核查記錄。

2.8菌種的標(biāo)識(shí)：
菌種代數(shù)的計(jì)算為干粉菌種為第0代，轉(zhuǎn)接一次加一代。具體標(biāo)識(shí)為：例單增李斯特氏菌第0代，標(biāo)識(shí)為DZ-0，第一代標(biāo)識(shí)為DZ-01第一代有12支，則DZ-01-01、……、DZ-01-12；并標(biāo)明日期：如2020.02.13這樣填寫。

2.9 菌種的保藏

①將試管內(nèi)菌種放入冰箱中2～8℃冷藏保存。

②將傳代并經(jīng)過培養(yǎng)后的菌種放入冰箱中2～8℃保存。每支保存菌種需標(biāo)明菌名、標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)、傳次、傳代日期。

2.10 菌種的銷毀

①菌種使用后或超過貯存期的應(yīng)進(jìn)行銷毀。

②需銷毀的菌種，應(yīng)用高壓蒸汽（121℃）滅菌30分鐘。

③滅菌后，再進(jìn)行清洗和處理。

④銷毀的菌種應(yīng)做好記錄。銷毀時(shí)由化驗(yàn)負(fù)責(zé)人監(jiān)督銷毀，保管人員負(fù)責(zé)銷毀。

1.斜面低溫保存法

將分純的待存菌接種于適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，得到充分生長(zhǎng)后，用封口膜封口，貼上標(biāo)簽，保存于4℃的冰箱中。此法操作簡(jiǎn)單、使用方便、不需要特殊設(shè)備，是實(shí)驗(yàn)室菌種保存最常用的方法。但保存時(shí)間短，一般每個(gè)月都要移種1次，而且菌種容易變異，所以此方法只適合實(shí)驗(yàn)室短期實(shí)驗(yàn)菌株的保存。

2.半固體瓊脂法 

用接種針將以分純的待存菌，穿刺接種于半固體中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)后出，封上無菌的液體石蠟，貼上標(biāo)簽，放4℃冰箱保存。此方法簡(jiǎn)便易操作，不需特殊設(shè)備、技術(shù)難度不大，但保存的時(shí)間不長(zhǎng)，一般只能保存1年以內(nèi)，而且對(duì)抵抗力弱以及一些特殊菌種大概只能存活3～6個(gè)月，需要頻繁的傳代，這樣很容易使菌株受到污染、變異。所以此方法不適用菌種的長(zhǎng)期保存，只適合實(shí)驗(yàn)室一些要求不高的菌種的短期保存。

3.液體石蠟保存法 

將液體石蠟滅菌，放于37℃恒溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉備用。再將已分純的待存菌 在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得到健壯的菌體，用無菌吸管吸取已滅菌的液體石蠟，注入已長(zhǎng)好的斜面培養(yǎng)基上，用量以高出斜面1cm為準(zhǔn)，將試管直立，貼上標(biāo)簽，置4℃下保存。此法制作簡(jiǎn)單，不需要特殊設(shè)備，菌種可以保存1年左右不需要經(jīng)常移種，缺點(diǎn)是保存的時(shí)候需要直立放置。此方法適合實(shí)驗(yàn)室短期保存，而且保存時(shí)需要一定的空間。

4.高層半固體瓊脂石蠟保存法

將待存菌經(jīng)平板劃線分離后，挑單個(gè)菌落用接種針反復(fù)穿刺接種到高固體瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)箱培養(yǎng)后取出，用滅菌過的液體石蠟滴加到半固體瓊菌種管表層約0.5cm高度，貼上標(biāo)簽，存放4℃冰箱。此法操作簡(jiǎn)便，不需要特殊設(shè)備，效果好，可以保存菌株1～2年。所以適合實(shí)驗(yàn)室菌株的較長(zhǎng)期的保存。

5.紙片法 

將已分純的待存菌用無菌鑷子鑷取紙片，在紙片上刮取4～5個(gè)菌落，入凍存管內(nèi)，蓋上蓋子后用封口膠布封住邊緣，貼上標(biāo)簽，放入冰箱冷凍保存(－20℃左右)。此方法具有操作簡(jiǎn)單、不需特殊設(shè)備、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、保存空間小等而且保存時(shí)間至少2年，但對(duì)一些營(yíng)養(yǎng)要求比較高的菌種，存活率不理想。所以方法適合實(shí)驗(yàn)室一些營(yíng)養(yǎng)要求不高的菌種較長(zhǎng)時(shí)間的保存。

6.甘油液保存法

將已分純的待存菌接種于肉湯中，37℃培養(yǎng)18～24h，然后按5份肉湯溶液、2份甘油－生理鹽水保存液的比例分裝于滅菌的微量離心管或細(xì)胞凍存管中，貼上標(biāo)簽，置－80℃～－20℃冰箱保存。此法操作簡(jiǎn)便，不需要特殊設(shè)備，效果好，可以保存菌種3年左右，無變異現(xiàn)象，而且此方法還可以保存一些要求較高的特殊菌種，適用范圍廣。所以此方法適合實(shí)驗(yàn)室普通菌種或特殊菌種的較長(zhǎng)期的保存。