其實(shí)我們一般微生物實(shí)驗(yàn)室自己還是可以做一些工作,特別是細(xì)菌的鑒定。再就是菌種鑒定時(shí),不是直接拿來(lái)就鑒定,需要一些預(yù)先做一些處理或判斷。現(xiàn)將一些基礎(chǔ)知識(shí)進(jìn)行總結(jié)如下:
一、相關(guān)定義
1、生理生化鑒定:根據(jù)微生物對(duì)各種生理?xiàng)l件(溫度、pH、氧氣、滲透壓)、生化指標(biāo)(唯1碳氮源、抗生素、酶、鹽堿性)代謝反應(yīng)進(jìn)行分析,并將結(jié)果轉(zhuǎn)化成軟件可以識(shí)別的數(shù)據(jù),進(jìn)行聚類(lèi)分析,與已知的參比菌株數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較,最終對(duì)未知菌進(jìn)行鑒定的一種技術(shù)。
2、革蘭氏染色:系細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法,染色后細(xì)菌與環(huán)境形成鮮明對(duì)比,可以清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)特征,而用以分類(lèi)鑒定。
3、平板劃線法:系指把雜菌樣品通過(guò)在平板表面劃線稀釋而獲得單菌落的方法。
4、氧化酶試驗(yàn):氧化酶不直接與氧化酶試劑起反應(yīng),而是先使細(xì)胞-色素C氧化,然后此氧化型細(xì)胞-色素C再使對(duì)苯二胺氧化,產(chǎn)生顏色反應(yīng)而進(jìn)行的試驗(yàn),用于區(qū)分不發(fā)酵的革蘭陰性桿菌(氧化酶陽(yáng)性)和腸道菌(氧化酶陰性)。
5、觸酶試驗(yàn):大多需氧和兼性厭氧菌均產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶,但鏈球菌屬陰性,故常用此試驗(yàn)來(lái)鑒定,用于區(qū)分葡萄球菌(過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性)和鏈球菌(過(guò)氧化氫酶陰性)。
6、凝固酶試驗(yàn):用于區(qū)分凝固酶陰性葡萄球菌(可推測(cè)為非致病性)和凝固酶陽(yáng)性葡萄球菌(很可能為致病性)。
二、工作程序
1、微生物鑒定程序
微生物鑒定的基本程序包括分離純化和鑒定,鑒定時(shí)一般先將待檢菌進(jìn)行初步的分類(lèi)。鑒定的方法有表型微生物鑒定和基因型微生物鑒定,根據(jù)所需要達(dá)到的鑒定水平選擇鑒定方法。目前實(shí)驗(yàn)室室進(jìn)行表型微生物鑒定后可以用API試劑條進(jìn)行或其他等效的試劑條進(jìn)行菌種鑒定,如API試劑條鑒定不能滿足要求時(shí)采取委外鑒定。
注:為了控制成本,可以自己進(jìn)行鑒定,不具備能力時(shí)再委外。API鑒定用的試劑條的效期有限,需要注意效期或跟供應(yīng)商做好溝通備貨。
1.1 待檢菌的分離與純化
微生物鑒定的第一步是待檢培養(yǎng)物的分離純化,最chang用的分離純化方法是挑去待檢菌的純培養(yǎng)物(單個(gè)菌落),必要時(shí)可進(jìn)一步進(jìn)行純培養(yǎng),為表型鑒定和隨后的鑒定程序提供足夠量的菌體。從藥物原材料、制藥用水、生產(chǎn)環(huán)境、中間產(chǎn)品和最終產(chǎn)品的樣品中檢出的受損微生物,經(jīng)分離純化程序使其由不利生存易產(chǎn)生變化的狀態(tài)變?yōu)樵跔I(yíng)養(yǎng)富集和最佳培養(yǎng)溫度條件下生存的穩(wěn)定狀態(tài),以保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性,具體詳見(jiàn)表1。
表1待檢菌的分離與純化明細(xì)表
1.1.1 平板劃線法
平板劃線方法一般通過(guò)連續(xù)畫(huà)蛇形曲線或四區(qū)劃線方法進(jìn)行。四區(qū)劃線具體步驟如下:先在平皿上做好標(biāo)識(shí),然后在選擇所獲得的新鮮菌種進(jìn)行劃線;左手持無(wú)菌平板,拇指和食指控制皿蓋,其余指控制皿底,打開(kāi)皿蓋,用接種環(huán)在皿上進(jìn)行劃線,一區(qū)要連續(xù)緊密的幾根平行線(如果菌量過(guò)多可以更換接種環(huán)),二區(qū)緊著著一區(qū)的最后一根線帶出來(lái),劃幾根平行線,然后三區(qū)、四區(qū)同樣的操作,四區(qū)應(yīng)盡量避免接觸到菌落密集區(qū),影響單菌落的形成;最后再選擇適宜的溫度進(jìn)行培養(yǎng)。
1.1 .2 稀釋倒平板法
首先把微生物懸液作一系列的稀釋?zhuān)ㄈ?:10、1:100、1:1000、1:10000),然后分別取不同稀釋液少許,與已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合,搖勻后,傾入滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中,待瓊脂凝固后,制成可能含菌的瓊脂平板,保溫培養(yǎng)一定時(shí)間即可出現(xiàn)菌落。
如果稀釋得當(dāng),在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個(gè)菌落,這個(gè)菌落可能就是由一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞繁殖形成的。隨后挑取該單個(gè)菌落,或重復(fù)以上操作數(shù)次,便可得到純培養(yǎng)。
1.1.3 涂布平板法
因?yàn)閷⑽⑸飸乙合燃拥捷^燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡,且采用稀釋倒平板法也會(huì)使一些嚴(yán)格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長(zhǎng),因此在微生物學(xué)研究中常用的純種分離方法是涂布平板法。
其做法是先將已熔化的培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平皿,制成無(wú)菌平板,冷卻凝固后,將一定量的微生物懸液滴加在平板表面,再用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個(gè)平板表面,經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落。
1.2 初篩實(shí)驗(yàn)
常規(guī)的微生物鑒定,一般要先進(jìn)行初篩試驗(yàn)確定待檢菌的基本微生物特征,將待檢菌進(jìn)行初步分類(lèi)。常見(jiàn)的初篩試驗(yàn)包括革蘭氏染色、芽孢染色、鏡檢觀察染色結(jié)果和細(xì)胞形態(tài)、重要的生化反應(yīng)等。
1.2.1 革蘭氏染色
原理:檢查細(xì)菌細(xì)胞壁的滲透性,染色前所有細(xì)胞是透明的,結(jié)晶紫著色后用碘增加染料與菌體結(jié)合,乙醇從G(-)菌體洗脫結(jié)晶紫,用番紅液復(fù)染,革蘭氏陰性菌呈粉紅色,革蘭氏陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色。
染色步驟:一般按照染色液說(shuō)明書(shū)規(guī)定進(jìn)行染色,如說(shuō)明書(shū)無(wú)明確說(shuō)明時(shí)按以下步驟進(jìn)行染色。結(jié)晶紫初染,在載玻片上滴一小滴純化水,用灼燒過(guò)的接種針挑取少量細(xì)菌,置載玻片的水滴中與水混合并涂抹開(kāi),涂抹要均勻平坦,涂抹后直徑約為1 cm的薄層。
將載玻片在火焰上方快速來(lái)回通過(guò)一兩次,以載玻片的加熱面接觸手背皮膚,不覺(jué)過(guò)燙為佳,待冷卻后再在火焰上方來(lái)回通過(guò)一兩次,再冷卻,重復(fù)操作直到薄層干燥為止;在制好的片上滴一滴草酸銨結(jié)晶紫,染色1 min后用水洗;碘液媒染,加碘液一滴,作用1 min后用水沖洗,用過(guò)濾紙吸干;乙醇脫色,用95%乙醇脫色,脫色時(shí)間大概為30 s。水洗后用過(guò)濾紙吸干;番紅復(fù)染,滴加0.5%的番紅染色液一滴,染色10~30 s后,用自來(lái)水沖洗。
鏡檢:先低倍鏡,再高倍鏡,最后油鏡觀察,觀察菌落形態(tài)與菌落顏色,菌落呈紅色即革蘭氏陰性菌,呈藍(lán)紫色為革蘭氏陽(yáng)性菌。
1.2.2 芽孢染色
一般按照染色液使用說(shuō)明進(jìn)行芽孢染色。如無(wú)明確說(shuō)明時(shí)按以下步驟進(jìn)行芽孢染色。涂片,先在載玻片上滴一滴純化水,用接種環(huán)灼燒過(guò)的接種針挑取少量細(xì)菌,置載玻片的水滴中與水混合并涂抹開(kāi),涂抹要均勻平坦,涂抹后直徑約為1 cm的薄層。
干燥固定,將載玻片在火焰上方快速來(lái)回通過(guò)一兩次,以載玻片的加熱面接觸手背皮膚,不覺(jué)過(guò)燙為佳,待冷卻后再在火焰上方來(lái)回通過(guò)一兩次,再冷卻,重復(fù)操作直到薄層干燥為止?兹妇G覆蓋,用木夾夾住載玻片一端,加數(shù)滴5%孔雀綠染液覆蓋涂片,在微火上加熱至染料冒蒸汽并開(kāi)始計(jì)時(shí),維持5min。
沖洗,待玻片冷卻后,用緩流自來(lái)水沖洗載玻片背面,直至流出的水無(wú)色為止。復(fù)染,用0.5%番紅染液覆蓋玻片,保持3min。 水洗干燥,用緩流自來(lái)水沖洗載玻片背面,直至流出的水無(wú)色為止,使其自然干燥。鏡檢,觀察菌落是否含有芽孢。
1.2.3 氧化酶試驗(yàn)(革蘭氏陰性桿菌)
革蘭氏陰性菌,做氧化酶試驗(yàn)。取將待檢菌落于無(wú)菌的濾紙片上,滴加一滴氧化酶試劑,反應(yīng)3分鐘,出現(xiàn)紫色為陽(yáng)性,反之為陰性。
1.2.4 非發(fā)酵菌鑒定
接種前把OF培養(yǎng)基在沸水浴溶解,在室溫冷卻后,每試驗(yàn)分裝 2個(gè)安培的固體OF培養(yǎng)基,利用接種針挑單個(gè)菌落,穿刺到OF培養(yǎng)基(深度約1cm.),把其中一個(gè)已接種好的安培(OF.F),用石蠟油覆蓋1cm. 把兩個(gè)安培蓋上塑料帽,培養(yǎng)35-37°C , 24 – 48小時(shí)。
結(jié)果判定:兩瓶均為黃色,則為發(fā)酵菌,則為發(fā)酵菌,兩管培養(yǎng)基一瓶顯示綠色F-,一瓶顯示黃色O+。
1.2.5 觸酶試驗(yàn)(革蘭氏陽(yáng)性菌)
玻片法:挑取被撿菌落于玻片上,直接用試劑進(jìn)行乳化,5s內(nèi)產(chǎn)生氣泡即為陽(yáng)性結(jié)果,反之為陰性。
1.3 表型微生物鑒定
表型微生物鑒定依據(jù)表型特征的表達(dá)來(lái)區(qū)分不同微生物間的差異,是經(jīng)典的微生物分類(lèi)鑒定法,以微生物細(xì)胞的形態(tài)和習(xí)性表型為主要指標(biāo),通過(guò)比較微生物的菌落形態(tài)、理化特征和特征化學(xué)成分與典型微生物的差異進(jìn)行鑒別。微生物分類(lèi)中使用的表型特征如表2。
表2 微生物分類(lèi)中使用的表性特征表