1.目的
規(guī)范本中心微生物實驗室培養(yǎng)基制備工作,保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。
2.適用范圍
本規(guī)程適用于使用商品化干粉培養(yǎng)基制備各種待用培養(yǎng)基。
3.職責
3.1培養(yǎng)基制備人員負責按本規(guī)程制備各類培養(yǎng)基,及時填寫成品培養(yǎng)基制備記錄,編制培養(yǎng)基目錄,粘貼標簽。
3.2 科室負責人:負責指導、監(jiān)督檢驗人員按規(guī)程制備培養(yǎng)基。
4.制備程序
4.1概述
4.1.1制備培養(yǎng)基所用的化學藥品,均為化學純。有些試劑在使用前應(yīng)先試用。
4.1.2使用脫水培養(yǎng)基和其他含有有害物質(zhì)(如膽鹽或其他選擇劑)的成分時,應(yīng)遵循良好實驗室規(guī)范和生產(chǎn)廠商提供的使用說明。
4.1.3使用商品化脫水合成培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基時,應(yīng)嚴格按照廠商提供的使用說明配制。如質(zhì)量/體積、PH、制備條件、滅菌條件和操作步驟等。
4.1.4使用各別成分制備培養(yǎng)基時,應(yīng)按配方準確配制,并記錄所使用成分的特性。
4.1.5制備培養(yǎng)基常用的容器為玻璃、不銹鋼鋁、鍋或搪瓷容器。不宜使用銅或鐵鍋。培養(yǎng)基中的含銅量過高時(>0.3mg/1000ml),細菌不易生長;含鐵量過高時(>0.14mg/1000ml),則妨礙細菌毒素的產(chǎn)生。
4.2水
4.2.1制備培養(yǎng)基應(yīng)使用蒸餾水或相同質(zhì)量的水,以排除測試條件下抑制或影響微生物生長的物質(zhì)。電阻率在25℃時應(yīng)≥300000Ω·cm。最好每周檢測一次。
4.2.2制備培養(yǎng)基時避免采用離子交換器生產(chǎn)的去離子水,其微生物含量可能較高,這種水在過濾滅菌后仍可能帶有細菌生長的抑制因子。
4.3稱量和復水
4.3.1稱量所需量的脫水培養(yǎng)基(注意緩慢操作,必要時佩戴口罩或在通風柜中操作,以防吸入含有有毒物質(zhì)的培養(yǎng)基粉末),先加入少量的水,充分混合(注意避免培養(yǎng)基結(jié)塊),然后再加水至所需的量。
4.3.2 必須選擇合適的天平和量筒,以確保稱量和移液的準確性。
4.4溶解和分裝
脫水培養(yǎng)基加水后應(yīng)適當加熱,并不停攪拌使其快速溶解,必要時,重新溶解。含瓊脂的培養(yǎng)基在加熱前應(yīng)先浸泡幾分鐘。用各別成分制備的培養(yǎng)基應(yīng)將不同成分分別加入適量的水中,并充分溶解,然后再加水至所需的量。
4.5 測定和調(diào)整PH
4.5.1用PH計或精密PH紙測pH,必要時進行調(diào)整。
4.5.2在實驗室用各別成分制備的培養(yǎng)基,除特殊說明外,培養(yǎng)基滅菌后冷卻至25℃時,PH的變化不應(yīng)超過0.2個單位。
4.5.3一般使用濃度約為40g/L(約1mol/L)的氫氧化鈉溶液或濃度約為36.5g/L(約1mol/L)的鹽酸溶液調(diào)整培養(yǎng)基的pH。
4.6分裝
將配制好的培養(yǎng)基根據(jù)使用要求分裝到適當?shù)娜萜髦校⒓皶r密封好。
4.7滅菌
4.7.1分裝好的培養(yǎng)基應(yīng)當天進行滅菌處理(2小時內(nèi)滅菌最佳)。
4.7.2實驗室采用濕熱滅菌對培養(yǎng)基進行滅菌處理,按照培養(yǎng)基使用說明采用合適的滅菌溫度和時間。
4.8保存
制就的培養(yǎng)基不宜保存過長,以少量勤做為宜。培養(yǎng)基存放于暗處和(或)4℃~12℃冰箱的密封袋或平皿筒中可延長貯存期限。
4.9制備記錄
培養(yǎng)基制備完畢后,應(yīng)及時填寫“成品培養(yǎng)基制備記錄”和“成品培養(yǎng)基目錄清單”,并在外包裝上貼好相應(yīng)的標簽,標明名稱,編號,制備日期和有效期等內(nèi)容。
培養(yǎng)基使用規(guī)程
1. 目的
規(guī)范本中心微生物實驗室培養(yǎng)基的使用和管理。
2. 適用范圍
本規(guī)程適用于培養(yǎng)基的儲存、融化和廢棄等。
3. 職責
3.1 檢驗人員:按照本規(guī)程規(guī)范使用培養(yǎng)基、定期檢查培養(yǎng)基是否失效。
3.2 科室負責人:負責指導、監(jiān)督檢驗人員規(guī)范使用培養(yǎng)基。
4.使用程序
4.1培養(yǎng)基的儲存
4.1.1除特殊說明和標準規(guī)定,通常情況下基礎(chǔ)培養(yǎng)基(如營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基)應(yīng)在4℃冰箱中保存不超過3個月,或在室溫(20℃)下保存不超過一個月。
4.1.2滅菌后的培養(yǎng)基應(yīng)置適當條件下保存至規(guī)定的有效期,并對保存條件進行確證,詳見表1。
表1 培養(yǎng)基2~8℃條件保存期限
培養(yǎng)基種類 |
保存條件 |
保存時間 |
平板培養(yǎng)基 |
不密封 |
2周 |
密封 |
6~8周 |
|
試管培養(yǎng)基 (棉塞) |
不密封 |
2~4周 |
密封 |
8~10周 |
|
試管培養(yǎng)基 (軟木塞或臘封) |
不密封 |
8周 |
密封 |
16~18周 |
4.2瓊脂培養(yǎng)基的融化
4.2.1將培養(yǎng)基放到沸水浴中或采用有相同效果的方法(如高壓鍋中的蒸汽,如100℃)使之融化。經(jīng)過高壓的培養(yǎng)基應(yīng)盡量減少重加熱時間,避免過度加熱。
4.2.2培養(yǎng)基融化后放入47℃±2℃的恒溫水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱中保溫,直至使用。
4.2.3融化后的培養(yǎng)基應(yīng)盡快使用,放置時間一般不應(yīng)超過4h,不可二次融化。
4.3培養(yǎng)基的脫氣
必要時,將培養(yǎng)基在使用前放到沸水浴或蒸汽浴中加熱15min,加熱時松開容器的蓋子;加熱后蓋緊,并迅速冷卻至使用溫度。
4.4添加成分的加入
對熱不穩(wěn)定的添加成分應(yīng)在培養(yǎng)基冷卻至47℃±2℃時再加入。滅菌的添加成分在加入之前,應(yīng)先放置到室溫,避免冷的液體造成瓊脂凝結(jié)或形成片狀物。將加入添加成分的培養(yǎng)基緩慢充分混勻,盡快分裝到待用的容器中。
4.5平板的制備和儲存
4.5.1傾注融化的培養(yǎng)基到平皿中,使之在平皿中形成一個至少2mm厚的瓊脂層(直徑90mm的平皿通常要加入15mL瓊脂培養(yǎng)基)。將平皿蓋好皿蓋后放到水平平面使瓊脂冷卻凝固。
4.5.2為了避免產(chǎn)生冷凝水,平板應(yīng)冷卻后再裝入袋中。貯存前不要對培養(yǎng)基表面進行干燥處理。
4.5.3凝固后的培養(yǎng)基應(yīng)立即使用或放于暗處和(或)4℃~12℃冰箱中,儲存期限見“4.1培養(yǎng)基的儲存”。 并在外包裝上貼好相應(yīng)的標簽,標明名稱,編號,制備日期和有效期等內(nèi)容。
4.5.4對于采用表面接種形式培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基。應(yīng)先對瓊脂表面進行干燥:揭開平皿蓋,將平板倒扣于烘箱/培養(yǎng)箱中(溫度設(shè)為25℃~50℃);或放在有對流風的無菌凈化臺中,直到培養(yǎng)基表面的水滴消失為止。注意不要過度干燥。商業(yè)化的平板瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)按照廠商提供的說明使用。
4.6培養(yǎng)
4.6.1培養(yǎng)時每垛最多堆放六個平板,平板間要留有空隙以保證空氣流通,使培養(yǎng)物的溫度盡快與培養(yǎng)箱溫度達到一致。
4.6.2在培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)基會損失水分。當水分損失的量大于培養(yǎng)基總量的15%時,就會影響微生物的生長。造成培養(yǎng)基水分損失的因素較多,如培養(yǎng)基成分,平皿中培養(yǎng)基總量和培養(yǎng)箱的類型等(如使用帶風扇的培養(yǎng)箱,培養(yǎng)箱中的濕度偏低,平板在培養(yǎng)箱中位置靠近培養(yǎng)箱內(nèi)壁等),操作時應(yīng)注意避免。
4.7培養(yǎng)基的棄置
培養(yǎng)基廢棄前,實驗室采用121℃、15分鐘蒸汽滅菌,或煮沸消毒30分鐘。