了解細(xì)菌革蘭氏染色原理，并掌握其方法。

二、原理

革蘭氏染色法是一種重要的鑒別細(xì)菌的方法，根據(jù)各種細(xì)菌對(duì)這種染色法的反應(yīng)不同，可把細(xì)菌分為革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性?xún)?/span>大類(lèi)。因此，該方法對(duì)于細(xì)菌的分類(lèi)，鑒定及生產(chǎn)應(yīng)用都有重要意義。其染色原理是利用細(xì)菌的細(xì)胞壁組成成分和結(jié)構(gòu)的不同，革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁肽聚糖層厚，交聯(lián)而成的肽聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)致密，經(jīng)乙醇脫色處理發(fā)生脫水作用，使孔徑縮小，通透性能降低，結(jié)晶紫與碘形成的大分子復(fù)合物保留在細(xì)胞內(nèi)而不被脫色，結(jié)果使細(xì)胞呈現(xiàn)紫色；而革蘭氐陰性菌肽聚糖層薄，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)少，脂類(lèi)含量較高，經(jīng)乙醇處理后，脂類(lèi)被溶解，細(xì)胞壁孔徑變大，通透性增加，結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物被溶出細(xì)胞壁，使細(xì)胞脫色。此時(shí)，再經(jīng)復(fù)紅或沙黃等紅色染料復(fù)染細(xì)胞呈紅色。

在革蘭氏染色中，有兩個(gè)值得注意的問(wèn)題。一是酒精脫色的時(shí)間要掌握恰當(dāng)，隨涂片
厚薄不同，脫色的時(shí)間也不完全一樣，一般以不溶出色素為止。若脫色過(guò)度則陽(yáng)性菌被誤染為陰性菌，而脫色不夠時(shí)陰性菌則被誤染為陽(yáng)性菌。二是培養(yǎng)物的老幼對(duì)染色結(jié)果也有影響，革蘭氏染色檢查的菌，必須是新培養(yǎng)物。

三、材料

1.菌種 培養(yǎng)10~12h的枯草桿菌及大腸桿菌。

2.儀器及其他 顯微鏡、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、玻片架、75%酒精消毒缸、鑷子、無(wú)菌水、草酸銨結(jié)晶紫、Lugol氏碘液、95%灑精、蕃紅染液、吸水紙、特種蠟筆。

四、方法與步驟

1.涂片 涂片、干燥、固定同簡(jiǎn)單染色法。

2.初染 滴加草酸銨結(jié)晶紫于涂片部位，染色時(shí)間為1min。
3.水洗 用水輕輕沖洗，洗去多余的染料。
4.滴加Lugol氏碘液1~2min，紫色部分變黑為止。
5.水洗 傾去Lugol氏碘液水洗。

6.脫色 滴加95%以上的酒精，約30〜60s (色素不溶出為止)。
7.水洗 同5水洗。 

8.復(fù)染 滴加蕃紅或沙黃染1~2min。
9.水洗 同5水洗。

10.干燥 自然干燥或用吸水紙吸干。

11.鏡檢 用油鏡觀察，記錄結(jié)果。