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      微生物檢測實(shí)驗(yàn)室無菌環(huán)境的維持!

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2018-10-17  來源:環(huán)凱微生物
      核心提示:在微生物實(shí)驗(yàn)室,必須達(dá)到一定程度的無菌狀態(tài),避免微生物污染。假如在一個(gè)不潔的實(shí)驗(yàn)室或者早先打翻過樣品的地方做微生物實(shí)驗(yàn),引入
       在微生物實(shí)驗(yàn)室, 必須達(dá)到一定程度的無菌狀態(tài), 避免微生物污染。 假如在一個(gè)不潔的實(shí)驗(yàn)室或者早先打翻過樣品的地方做微生物實(shí)驗(yàn), 引入新的微生物污染樣品的幾率是很大的。

      微生物的實(shí)驗(yàn)可以分為兩大部分:前期準(zhǔn)備和樣品檢驗(yàn)。

      事實(shí)上,保持整個(gè)實(shí)驗(yàn)室清潔是非常重要的, 這樣就不用在滅菌前擔(dān)心太多了, 然而, 滅菌后必須保證樣品或者培養(yǎng)基免受污染。其實(shí), 可以把滅菌想像成”一扇門”, 在培養(yǎng)基中或者一些設(shè)備比如吸管的微生物都在滅菌過程中被殺死了,沒有微生物困擾實(shí)驗(yàn)了。必須保證滅菌后的環(huán)境(門后的部分)的潔凈, 杜絕滅菌后的培養(yǎng)基和設(shè)備受到污染。

      一、無菌的重要性

      1. 無菌技術(shù) – 高壓濕熱滅菌

      要點(diǎn)

      描述

      原理

      在壓力下產(chǎn)生的濕熱的蒸汽殺死微生物的營養(yǎng)體和孢子。 

      密封

      滅菌鍋必須密閉以阻隔外部空氣, 避免空氣的存在會影響壓力并降低滅菌鍋里面的溫度。

      滅菌壓力

      在滅菌鍋內(nèi), 合適的滅菌溫度是通過壓力達(dá)到的, 壓力對于滅菌沒有效用但是使蒸汽溫度上升。 對于標(biāo)準(zhǔn)操作來說,15lbs/inch2時(shí)的121℃并趕走所有空氣可以達(dá)到滅菌的效果。

      滅菌時(shí)間

      當(dāng)?shù)竭_(dá)一定的溫度和壓力時(shí), 需要保持一定的時(shí)間來達(dá)到效果,為了殺滅微生物,121℃必須保持至少15分鐘。

      培養(yǎng)基滅菌

      大部分情況下, 實(shí)驗(yàn)室配置培養(yǎng)基后應(yīng)滅菌,滅菌時(shí)應(yīng)根據(jù)供應(yīng)商指導(dǎo), 使用合適的溫度時(shí)間; 有些培養(yǎng)基不適合滅菌的。

      器皿滅菌

      當(dāng)滅菌器皿時(shí),需要考慮使用數(shù)量,比如,一天用10根吸管,在滅菌時(shí), 一般就可以以10根為一包, 這樣可以減低器皿在使用過程中遭受微生物的污染的可能性。

      滅菌條

      在滅菌過程中, 可以用滅菌條來監(jiān)控效果, 滅菌條在滅菌前是有顏色的,滅菌后會變成黑色。

      重新滅菌

      假如一次滅菌無效, 可以重新進(jìn)行滅菌過程, 但是,培養(yǎng)基是不可以進(jìn)行第二次滅菌的, 應(yīng)拋棄。

      儲存

      滅菌完成后, 培養(yǎng)基和器皿應(yīng)妥善儲存。 一般來說, 培養(yǎng)基應(yīng)存放于避光的潔凈空間,同時(shí)應(yīng)參照供應(yīng)商的指示。



      2.無菌技術(shù) – 過濾 (Filtration)

       

      要點(diǎn)

      描述

      簡述

      物理分離方法, 使用高效過濾將微生物從液體培養(yǎng)基分離。

      由于不需要加熱和冷卻過程,過濾比高溫濕熱滅菌省時(shí)間。

      過濾頭

      0.2微米的過濾頭可以分離所有的細(xì)菌營養(yǎng)體, 把它安裝在針筒末端。



      3.無菌過程注意點(diǎn)

      要點(diǎn)

      描述

      綜述

      一旦培養(yǎng)基或者器皿經(jīng)過滅菌過程, 這種滅菌狀態(tài)應(yīng)保持直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

      區(qū)域

      最好能把培養(yǎng)基準(zhǔn)備區(qū)域(門外)和實(shí)驗(yàn)區(qū)域(門內(nèi))之間應(yīng)該設(shè)有緩沖間。

      工作臺面

      工作前必須消毒, 可以用70%的酒精, 也可以用含氯的消毒劑。 

      消毒時(shí)間

      不管使用何種消毒劑, 需要提供充分的消毒時(shí)間來殺滅微生物,一般5-10分鐘, 可以用紙巾擦干表面。

      潔凈臺

      必須有2個(gè)光源:普通照明用和殺菌紫外光。紫外燈用于保持工作臺面免于微生物污染, 在使用前仍然需要使用消毒劑清潔。

      擺放

      應(yīng)該有好習(xí)慣把工作桌面的物品擺放好,,把移動(dòng)放到最低限度, 避免帶來污染。

      鑷子

      如果使用薄膜過濾法, 需要準(zhǔn)備一個(gè)小燒杯并有少量酒精, 鑷子不用時(shí)就放在杯子里。

      培養(yǎng)基

      培養(yǎng)基使用前, 應(yīng)該有相關(guān)日期, 比如配置日期, 或者實(shí)驗(yàn)室收到日期(直接使用的培養(yǎng)基)。假如沒有所需日期, 這個(gè)培養(yǎng)基不能使用。

      實(shí)驗(yàn)服

      穿著干凈的實(shí)驗(yàn)服, 袖子應(yīng)卷起至肘部以避免碰到培養(yǎng)基或樣品帶來污染,當(dāng)然。做實(shí)驗(yàn)前要洗手。

       


      4. 實(shí)驗(yàn)的無菌技術(shù)注意點(diǎn)

      采樣

      個(gè)人

      酒精燈

      樣品應(yīng)無菌采得,

      使用無菌采樣袋或者采樣瓶,

      采樣員應(yīng)戴防護(hù)手套, 在采樣前燒采樣口,

      樣品容器應(yīng)緊閉并安全儲存。

       

      萬一培養(yǎng)基或者樣品濺到實(shí)驗(yàn)服上應(yīng)在做完一個(gè)實(shí)驗(yàn)后換上干凈的。

      咳嗽或者鼻塞可能會帶來微生物并影響實(shí)驗(yàn),應(yīng)戴好防護(hù)手套面罩 

       

      使用本森燈或者酒精燈, 在實(shí)驗(yàn)前點(diǎn)燃。

      火焰在實(shí)驗(yàn)區(qū)域產(chǎn)生一個(gè)防層, 可以防止那些懸浮在空氣中的微生物掉落在工作臺面上或者培養(yǎng)基上。

       

      開瓶

      瓶口

      培養(yǎng)皿

      開瓶前, 應(yīng)用清潔劑的紙巾清潔瓶蓋和附近區(qū)域,除去蓋子上可能留存的微生物。

      蓋子打開后,玻璃瓶口應(yīng)進(jìn)行滅菌,可以在酒精燈上方旋轉(zhuǎn)瓶口和螺紋, 一般2-3秒。 

      當(dāng)打開培養(yǎng)皿時(shí), 不能完全移除蓋子, 而應(yīng)該保持在培養(yǎng)皿的上側(cè), 從而能夠倒入培養(yǎng)基或者樣品, 這樣可以減少空氣灰塵或者微生物的污染。

      倒完培養(yǎng)基或者樣品后, 瓶口重新過火, 蓋蓋子, 用消毒劑清潔。 

       

      濾膜

      鑷子

       

      打開薄膜裝, 絕對不能碰到薄膜! 

      用鑷子把薄膜移除包裝并放到過濾頭上, 過濾的漏斗不能完全移開,只需移開一點(diǎn)點(diǎn)放入濾膜即可,

      過濾完后,用鑷子把濾膜轉(zhuǎn)到培養(yǎng)皿中, 放置于中間。

       

      用鑷子轉(zhuǎn)移濾膜

      過火時(shí),拿住鑷子的尾部, 放到火焰上, 保持一下能夠到火好, 時(shí)間太長會在尖部結(jié)碳,

      拿鑷子的時(shí)候, 尾部向上直至燒完。

       

       

       

      實(shí)驗(yàn)結(jié)束

      打掃

      廢棄物

      實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱;剩余的培養(yǎng)基可以放回儲存區(qū)域, 蓋子必須蓋緊。

      拋棄廢棄物,比如樣品袋; 可回用的物品放在遠(yuǎn)離工作區(qū)域的地方以回收, 清洗, 滅菌。

      用含有消毒劑的紙巾清潔工作臺面。

       

      在實(shí)驗(yàn)過程中暴露于微生物的物品應(yīng)作為有害廢棄物

      這些廢棄物可能含有微生物并致病; 假如含有致病菌可能會產(chǎn)生公共衛(wèi)生的事件.

      最好廢棄物能夠進(jìn)行濕熱滅菌

      從微生物的實(shí)驗(yàn)室布局角度


      二、從微生物的實(shí)驗(yàn)室布局角度

      一個(gè)設(shè)計(jì)合理的實(shí)驗(yàn)室能提供一個(gè)合格的環(huán)境以支持實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虬踩行У剡M(jìn)行。 首先,需要為實(shí)驗(yàn)室選擇一個(gè)合適的物理位置:

      遠(yuǎn)離其他操作區(qū)域,比如,生產(chǎn)或者儲運(yùn);

      沒有從其他區(qū)域進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的直接入口;

      實(shí)驗(yàn)室必須是微生物實(shí)驗(yàn)專用;

      應(yīng)有專門微生物檢測無菌間,并通過緩沖間與準(zhǔn)備間等進(jìn)行區(qū)隔。

      通風(fēng)和氣流

      安保

      工作區(qū)域

      微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該有單獨(dú)的通風(fēng)系統(tǒng), 與其他操作區(qū)域的空氣供給分開;

      空調(diào)系統(tǒng)的排氣必須直接排出實(shí)驗(yàn)室, 空調(diào)系統(tǒng)應(yīng)定時(shí)清洗, 并關(guān)注空氣過濾器的清潔。

      實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該是限制進(jìn)入的, 可以是卡片控制或者其他方式, 只有那些被允許進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的人員才能進(jìn)入。

      實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)該有充足的工作區(qū)域, 從GLP標(biāo)準(zhǔn)來說, 每人應(yīng)有20平方米的區(qū)域. 充足的工作區(qū)域可以避免工作中人員的碰撞, 也避免了交叉污染。

      易清潔

      照明

      反饋

      實(shí)驗(yàn)室的墻面, 屋頂和門都應(yīng)該是平滑的, 光潔易于清洗消毒的;

      墻的接縫包括強(qiáng)和墻之間, 強(qiáng)和地面之間應(yīng)該是弧形的;

      任何地方都應(yīng)該不能聚集灰塵, 例如窗臺或者窗簾;

      柜子應(yīng)該是可移動(dòng)的或者是不著地的以方便清掃。

       

      實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有充足的照明, 包括不間斷電源或者備用發(fā)電機(jī). 

      反饋



      三、遵照GLP相關(guān)的安全規(guī)則

      1. GLP要點(diǎn) – 工作區(qū)域

      要點(diǎn)

      描述

      總體安排

      實(shí)驗(yàn)前應(yīng)做好儀器, 試劑和培養(yǎng)基的所有準(zhǔn)備工作, 這樣可以合理利用時(shí)間并得到穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

      桌面安放

      多余的培養(yǎng)皿, 燒瓶或者濾紙可能會干擾實(shí)驗(yàn)并帶來潛在的濺出, 打碎或者交叉污染。

      實(shí)驗(yàn)前消毒

      在配制培養(yǎng)基或者開始試驗(yàn)前, 應(yīng)該清潔并消毒工作桌面。 可以采用70%的酒精溶液, 含氯水的溶液, 或者其他消毒劑。清潔后, 應(yīng)等待幾分鐘以使有充分的時(shí)間殺滅微生物。

      試驗(yàn)后消毒

      實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 徹底清潔工作區(qū)域, 仍然使用70%酒精溶液或者其他消毒劑, 保持一段時(shí)間, 然后擦干。

      有害廢棄物的處置

      必須有效管理微生物的有毒廢棄物, 任何和微生物培養(yǎng)或者培養(yǎng)基相關(guān)的物品都應(yīng)被看作有害物質(zhì);  因?yàn)樗麄兛赡芎兄虏【? 需要小心處理。

      廢棄物的滅菌

      濕熱滅菌是最簡單也是最有效的處理污染物質(zhì)和有害物質(zhì)的方法。 用過的培養(yǎng)皿應(yīng)放在滅菌袋中。 滅菌后, 可以當(dāng)作一般廢棄物處理。

      重復(fù)使用器皿的滅菌

      當(dāng)需要對小件物品(比如移液管)滅菌時(shí), 可以根據(jù)實(shí)際用量分組包裝。 濕熱滅菌后, 袋包裝冷卻并保存。

      避免浪費(fèi)

      合理安排是非常重要的; 實(shí)驗(yàn)室工作需要精準(zhǔn), 但是有時(shí)候我們也需要快速工作, 因?yàn)榛ǚ浅6鄷r(shí)間會延長設(shè)備, 培養(yǎng)基, 或者樣品暴露在環(huán)境中的時(shí)間。 把需要用的物品放在手邊可以用的地方可以節(jié)約時(shí)間并提高工作的有效性。

       


      2. GLP要點(diǎn) – 潔凈工作臺

      簡介

      使用

      監(jiān)控

      潔凈工作臺提供了控制來自環(huán)境的污染并提供工作區(qū)域的潔凈空氣. 潔凈空氣吹向工作區(qū)域, 同時(shí), 可以避免外部空氣進(jìn)入工作區(qū)域

      使用時(shí), 紫外光線(或者紫外燈)應(yīng)關(guān)閉, 但是使用后應(yīng)打開. 如果紫外燈沒有打開工作臺沒有開啟, 工作臺不能開始使用; 必須清潔工作臺, 開啟電源并打開紫外燈, 保持30分鐘. 

      潔凈工作臺需要進(jìn)行日常的確認(rèn), 一般有第三方公司進(jìn)行


      三、一個(gè)有效的實(shí)驗(yàn)室

      應(yīng)該是一個(gè)安全的實(shí)驗(yàn)室。 假如疏忽安全的話, 許多每天使用的培養(yǎng)基或者設(shè)備會產(chǎn)生危害。 減少這些危害帶來的風(fēng)險(xiǎn)不僅僅保護(hù)了工作場所, 更重要的是, 保護(hù)了自身免于危險(xiǎn)。

      利用常識并遵照GLP相關(guān)的安全規(guī)則, 我們就能把由于微生物相關(guān)的行為帶來的潛在危害降低到最小
      。
       

      安全用品

      移動(dòng)

      安全用品包含口罩, 手套和眼部防護(hù)。 

      口罩防止培養(yǎng)基和樣品受到污染, 可能來自于咳嗽或者鼻涕; 根據(jù)當(dāng)?shù)氐囊蠛土?xí)慣, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)室會有不同的要求。

      戴手套是為了防止培養(yǎng)基或者其他刺激性物質(zhì)接觸皮膚; 在從濕熱滅菌鍋內(nèi)取出容器或則器皿時(shí), 需要戴防熱手套。

      在配置培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)中佩戴防護(hù)眼鏡是一個(gè)很好的習(xí)慣, 能夠購買帶有屈光度的防護(hù)眼鏡為佳。

      當(dāng)移動(dòng)培養(yǎng)基或者樣品時(shí), 應(yīng)小心注意以避免濺出或者潑出;

      突然的移動(dòng)會產(chǎn)生安全危害或者導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無效;

      不要使用夸張的動(dòng)作或者行為

      同時(shí), 不要把任何東西, 比如吸管, 放到嘴里。

       

       明火

      濕熱滅菌鍋

      實(shí)驗(yàn)中需要用到酒精燈或其他明火, 但是假如使用不當(dāng)會帶來比較高的安全危險(xiǎn);

      確保酒精燈不用時(shí)完全關(guān)閉, 當(dāng)有閥門時(shí)經(jīng)常檢查墊圈是否有裂痕或者泄露;

      操作酒精燈時(shí), 應(yīng)確保火焰不會接觸衣物或者皮膚. 可燃物品, 比如記錄本, 應(yīng)遠(yuǎn)離火焰以避免意外點(diǎn)燃;

      同時(shí), 要注意可燃液體的容器. 每次使用后應(yīng)蓋好蓋子并遠(yuǎn)離酒精燈火焰;

      使用火焰進(jìn)行滅菌工作時(shí), 可使用鑷子. 把鑷子放在含有95%酒精的燒杯中, 使用時(shí), 把鑷子在火焰上灼燒1-2秒, 移開鑷子并等待火焰熄滅; 

      拿著鑷子是尖端應(yīng)向下, 使熱的酒精不會流到手上。

       

      濕熱滅菌鍋使用高壓下產(chǎn)生的蒸汽, 溫度可達(dá)1210C,  殺死了微生物, 同樣可以帶來人類組織的灼傷, 所以必須特別小心地操作; 

      如此高的溫度以及蒸汽能帶來極大的潛在傷害, 即使是殘留的蒸汽也能帶來很大的危險(xiǎn). 打開滅菌鍋時(shí)需要特別小心, 站在邊上避免面對熱量和蒸汽, 緩慢的打開門, 同時(shí), 戴好防熱手套. 

      把需要滅菌的培養(yǎng)基和器皿平均放置在托盤上, 大的物品放在邊上, 確保物品不會相互碰撞. 這樣可以是熱量均勻擴(kuò)散并平衡整個(gè)托盤

       

      潔凈臺

      樣品操作

      在潔凈臺工作時(shí)必須關(guān)閉紫外燈. 紫
      外光線是危險(xiǎn)的;

      不要把手或者手指放在紫外燈下, 以免灼傷皮膚;

      不要直接看紫外光線以免損傷眼睛。

       

      培養(yǎng)基和樣品: 用火焰灼燒瓶口時(shí), 停留4-5秒, 旋轉(zhuǎn)使整個(gè)表面都能被灼燒, 不要停留太久, 不要濺出樣品或者培養(yǎng)基;

      假如樣品是瓶裝的, 不要直接灼燒以免爆開. 可以取2個(gè)燒杯, 倒入70%酒精, 把瓶子倒置放入一個(gè)燒杯中, 使蓋子和瓶頸的2.5厘米處能浸沒在酒精中, 拿出瓶子用干凈的布擦干; 同理, 放入第二個(gè)燒杯, 拿出瓶子直立待酒精自然蒸發(fā);

      開瓶時(shí)應(yīng)特別小心不能污染樣品, 可以用消毒紙巾開旋蓋的瓶子; 用浸沒在95%酒精并灼燒的開瓶器打開壓蓋瓶;

      打開瓶子后, 使用相同的方法灼燒瓶口, 并確保用于消毒的酒精完全揮發(fā);

      拉罐可以使用相同的程序或者用含70%酒精的棉球擦拭頂部, 假如罐子必須用開罐器, 這個(gè)開罐器操作同開瓶器;

      無菌包裝的產(chǎn)品用含70%酒精的棉球擦拭。

       



      四、微生物防護(hù)用具

      1.一級防護(hù)(設(shè)備)

      1.1移液輔助器,如移液器

      1.2生物安全柜

      1.3一次性塑料接種環(huán)、電熱接種環(huán)

      1.4螺口蓋試管及瓶子

      1.5高壓滅菌器

      1.6一次性塑料移液管

       

      2.二級防護(hù)(人員)

      2.1工作服、防護(hù)服

      2.2手套(乳膠手套等)

      2.3安全眼鏡、面罩或其他防護(hù)用品


      編輯:songjiajie2010

       
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