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      ATCC細(xì)胞 冷凍及解凍方法

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2013-08-28  來源:實(shí)驗(yàn)室資訊網(wǎng)
      核心提示:一、細(xì)胞冷凍保存1、材料:生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO(Sigma D-2650)、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)、
       一、細(xì)胞冷凍保存
      1、材料:
      生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO(Sigma D-2650)、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片、等速降溫機(jī)(KRYO10SeriesII)。
      2、冷凍保存方法:
      (1)傳統(tǒng)方法:冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16~18小時(shí)(或隔夜)→液氮槽vaporphase長期儲存。-20℃不可超過1小時(shí),以防止冰晶過大,造成細(xì)胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。 
      (2)程序降溫:利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1~-3℃/分鐘之速度由室溫降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。 
      3、步驟: 
      (1)冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基,觀察細(xì)胞生長情形。 
      (2)配制冷凍保存溶液(使用前配制):將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中,最后濃度為5~10%,混合均勻,置于室溫下待用。
      (3)依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作,收集培養(yǎng)之細(xì)胞,取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
      (4)離心,去除上清液,加入適量冷凍保存溶液,使細(xì)胞濃度為1~5×106cells/ml,混合均勻,分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中,1ml/vial,并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測。 
      4、注意事項(xiàng): 
      (1)欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(logphase)且存活率高之狀態(tài),約為80–90%致密度。 
      (2)冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì),例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。
      (3)注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級等級,無菌且無色(以0.22micron FGLP Telflon過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品,如Sigma D-2650),以5~10ml小體積分裝,4℃避光保存,勿作多次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級等級,以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用,因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性。 
      ATCC細(xì)胞 冷凍及解凍方法(4)冷凍保存之細(xì)胞濃度:
      ①normal human fibroblast:1~3×106cells/ml 
      ②hybridoma:1~3×106cells/ml,細(xì)胞濃度不要太高,某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時(shí)后死去。 
      ③adherent tumor lines:5~7×106,依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度,而HeLa只需1~3×106cells/ml 
      ④other suspensions:5~10×106cells/ml,human lymphocyte須至少5×106cells/ml。 
      (5)冷凍保護(hù)劑濃度為5或10%DMSO,若是不確定細(xì)胞之冷凍條件,在做冷凍保存之同時(shí),亦應(yīng)作一個(gè)backup culture,以防止冷凍失敗。 
       
      二、冷凍細(xì)胞活化 
       
      1、冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍,以避免冰晶重新結(jié)晶而對細(xì)胞造成傷害,導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。 
      2、細(xì)胞活化后,約需數(shù)日,或繼代一至二代,其細(xì)胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。 
      3、材料 :37℃恒溫水槽、新鮮培養(yǎng)基、無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶、液氮或干冰容器 。
      4、步驟: 
      (1)操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套,防止冷凍管可能爆裂之傷害。 
      (2)自液氮或干冰容器中取出冷凍管,檢查蓋子是否旋緊,由于熱脹冷縮過程,此時(shí)蓋子易松掉。
      (3)將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫,回溫后噴以70%酒精并擦拭之,移入無菌操作臺內(nèi)。
      (4)取出冷凍管,立即放入37℃水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入無菌操作臺內(nèi)。 
      (5)取出解凍之細(xì)胞懸浮液,緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為1:10~1:15),混合均勻,放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取0.1ml解凍細(xì)胞懸浮液作存活測試。
      (6)解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑(例如DMSO或glycerol),依細(xì)胞種類而異,一般而言,大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。惟若要立即去除,則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi),離心1000rpm,5分鐘,移去上清液,加入新鮮培養(yǎng)基,混合均勻,放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 
      (7)若不需立即去除冷凍保存劑,則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。
      編輯:songjiajie2010

       
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