微生物具有容易變異的特性,因此,在保藏過程中,必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態(tài),才能在一定的時(shí)間內(nèi)使其不發(fā)生變異而又保持生活能力.

    低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素,所以,菌種保藏方法雖多,但都是根據(jù)這三個(gè)因素而設(shè)計(jì)的.

 

二、保藏方法

    大致可分為以下幾種：

1. 傳代培養(yǎng)保藏法

    又有斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等(后者作保藏厭氧細(xì)菌用),培養(yǎng)后于4-6℃冰箱內(nèi)保存.

2. 液體石蠟覆蓋保藏法

    是傳代培養(yǎng)的變相方法,能夠適當(dāng)延長保藏時(shí)間,它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋滅菌的液體石蠟,一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡,另一方面可阻止氧氣進(jìn)入,以減弱代謝作用.

3. 載體保藏法

    是將微生物吸附在適當(dāng)?shù)妮d體,如土壤、沙子、硅膠、濾紙上,而后進(jìn)行干燥的保藏法,例如沙土保藏法和濾紙保藏法應(yīng)用相當(dāng)廣泛.

4. 寄主保藏法

    用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物,如病毒、立克次氏體、螺旋體等,它們必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內(nèi)感染并傳代,此法相當(dāng)于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法.病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進(jìn)行保藏.

5. 冷凍保藏法

    可分低溫冰箱(-20-30℃,-50-80℃)、干冰酒精快速凍結(jié)(約-70℃)和液氮(-196℃)等保藏法.

6. 冷凍干燥保藏法

    先使微生物在極低溫度(-70℃左右)下快速冷凍,然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分(真空干燥).

    有些方法如濾紙保藏法、液氮保藏法和冷凍干燥保藏法等均需使用保護(hù)劑來制備細(xì)胞懸液,以防止因冷凍或水分不斷升華對細(xì)胞的損害.保護(hù)性溶質(zhì)可通過氫和離子鍵對水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親和力來穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型.保護(hù)劑有牛乳、血清、糖類、甘油、二甲亞砜等.

 

三、器材

    細(xì)菌、酵母菌,放線菌和霉菌；

    肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基,滅菌脫脂牛乳,滅菌水,化學(xué)純的液體石蠟,甘油,五氧化二磷,河沙,瘦黃土或紅土,冰塊、食鹽,干冰,95%酒精,10%鹽酸,無水氯化鈣；

    滅菌吸管,滅菌滴管,滅菌培養(yǎng)皿,管形安瓿管,淚滴形安瓿管(長頸球形底),40目與 100目篩子,油紙,濾紙條(0.5×1.2cm),干燥器,真空泵,真空壓力表,噴燈,L形五通管,冰箱,低溫冰箱(-30℃),液氮冷凍保藏器.

 

四、操作步驟、各保藏法的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)

    下列各法可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室具體條件與需要選做.

1. 斜面低溫保藏法

    將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上,待菌充分生長后,棉塞部分用油紙包扎好,移至2-8℃的冰箱中保藏.

    保藏時(shí)間依微生物的種類而有不同,霉菌、放線菌及有芽孢的細(xì)菌保存2-4個(gè)月,移種一次.酵母菌兩個(gè)月,細(xì)菌最好每月移種一次.

    此法為實(shí)驗(yàn)室和工廠菌種室常用的保藏法,優(yōu)點(diǎn)是操作簡單,使用方便,不需特殊設(shè)備,能隨時(shí)檢查所保藏的菌株是否死亡、變異與污染雜菌等.缺點(diǎn)是容易變異,因?yàn)榕囵B(yǎng)基的物理、化學(xué)特性不是嚴(yán)格恒定的,屢次傳代會使微生物的代謝改變,而影響微生物的性狀；污染雜菌的機(jī)會亦較多.

2. 液體石蠟保藏法

(1)將液體石蠟分裝于三角燒瓶內(nèi),塞上棉塞,并用牛皮紙包扎,1.05kg/cm2>,121.3℃滅菌30分鐘,然后放在40℃溫箱中,使水汽蒸發(fā)掉,備用.

(2)將需要保藏的菌種,在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng),使得到健壯的菌體或孢子.

(3)用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟,注入已長好菌的斜面上,其用量以高出斜面頂端1cm為準(zhǔn),使菌種與空氣隔絕.

(4)將試管直立,置低溫或室溫下保存(有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時(shí)間還要長).

    此法實(shí)用而效果好.霉菌、放線菌、芽孢細(xì)菌可保藏2年以上不死,酵母菌可保藏1-2年,一般無芽孢細(xì)菌也可保藏1年左右,甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌,在37℃溫箱內(nèi),亦可保藏3個(gè)月之久.此法的優(yōu)點(diǎn)是制作簡單,不需特殊設(shè)備,且不需經(jīng)常移種.缺點(diǎn)是保存時(shí)必須直立放置,所占位置較大,同時(shí)也不便攜帶.從液體石蠟下面取培養(yǎng)物移種后,接種環(huán)在火焰上燒灼時(shí),培養(yǎng)物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺,應(yīng)特別注意.

3. 濾紙保藏法

(1)將濾紙剪成0.5×1.2cm的小條,裝入0.6×8cm的安瓿管中,每管1-2張,塞以棉塞,1.05kg/cm2>,121.3℃滅菌30分鐘.

(2)將需要保存的菌種,在適宜的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng),使充分生長.

(3)取滅菌脫脂牛乳1-2ml滴加在滅菌培養(yǎng)皿或試管內(nèi),取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內(nèi)混勻,制成濃懸液.

(4)用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內(nèi),使其吸飽,再放回至安瓿管中,塞上棉塞.

(5)將安瓿管放入內(nèi)有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中,用真空泵抽氣至干.

(6)將棉花塞入管內(nèi),用火焰熔封,保存于低溫下.

(7)需要使用菌種,復(fù)活培養(yǎng)時(shí),可將安瓿管口在火焰上燒熱,滴一滴冷水在燒熱的部位,使玻璃破裂,再用鑷子敲掉口端的玻璃,待安瓿管開啟后,取出濾紙,放入液體培養(yǎng)基內(nèi),置溫箱中培養(yǎng).

    細(xì)菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏,前兩者可保藏2年左右,有些絲狀真菌甚至可保藏14-17年之久.此法較液氮、冷凍干燥法簡便,不需要特殊設(shè)備.

4. 沙土保藏法

(1)取河沙加入10%稀鹽酸,加熱煮沸30分鐘,以去除其中的有機(jī)質(zhì).

(2)倒去酸水,用自來水沖洗至中性.

(3)烘干,用40目篩子過篩,以去掉粗顆粒,備用.

(4)另取非耕作層的不含腐植質(zhì)的瘦黃土或紅土,加自來水浸泡洗滌數(shù)次,直至中性.

(5)烘干,碾碎,通過100目篩子過篩,以去除粗顆粒.

(6)按一份黃土、三份沙的比例(或根據(jù)需要而用其他比例,甚至可全部用沙或全部用土)摻合均勻,裝入10×100mm的小試管或安瓿管中,每管裝1g左右,塞上棉塞,進(jìn)行滅菌,烘干.

(7)抽樣進(jìn)行無菌檢查,每10支沙土管抽一支,將沙土倒入肉湯培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)48小時(shí),若仍有雜菌,則需全部重新滅菌,再作無菌試驗(yàn),直至證明無菌,方可備用.

(8)選擇培養(yǎng)成熟的(一般指孢子層生長豐滿的,營養(yǎng)細(xì)胞用此法效果不好)優(yōu)良菌種,以無菌水洗下,制成孢子懸液.

(9)于每支沙土管中加入約0.5ml(一般以剛剛使沙土潤濕為宜)孢子懸液,以接種針拌勻.

(10)放入真空干燥器內(nèi),用真空泵抽干水分,抽干時(shí)間越短越好,務(wù)使在12小時(shí)內(nèi)抽干.

(11)每10支抽取一支,用接種環(huán)取出少數(shù)沙粒,接種于斜面培養(yǎng)基上,進(jìn)行培養(yǎng),觀察生長情況和有無雜菌生長,如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少或根本不長,則說明制作的沙土管有問題,尚須進(jìn)一步抽樣檢查.

(12)若經(jīng)檢查沒有問題,用火焰熔封管口,放冰箱或室內(nèi)干燥處保存.每半年檢查一次活力和雜菌情況.

(13)需要使用菌種,復(fù)活培養(yǎng)時(shí),取沙土少許移入液體培養(yǎng)基內(nèi),置溫箱中培養(yǎng).

    此法多用于能產(chǎn)生孢子的微生物如霉菌、放線菌,因此在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣,效果亦好,可保存2年左右,但應(yīng)用于營養(yǎng)細(xì)胞效果不佳.

5. 液氮冷凍保藏法

(1)準(zhǔn)備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管,要求能耐受溫度突然變化而不致破裂,因此,需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管,安瓿管的大小通常使用75×10mm的,或能容1.2mm液體的.

(2)加保護(hù)劑與滅菌保存細(xì)菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細(xì)胞時(shí),則將空安瓿管塞上棉塞,1.05kg/cm2,121.3℃滅菌15分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先加入保護(hù)劑如10%的甘油蒸餾水溶液或10%二甲亞砜蒸餾水溶液,加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限,而后再用 1.05kg/cm2>,121.3℃滅菌15分鐘.

(3)接入菌種將菌種用10%的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液,裝入已滅菌的安瓿管；霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器,從平板內(nèi)切取菌落圓塊,放入含有保護(hù)劑的安瓿管內(nèi),然后用火焰熔封.浸入水中檢查有無漏洞.

(4)凍結(jié)再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結(jié)至-30℃.若細(xì)胞急劇冷凍,則在細(xì)胞內(nèi)會形成冰的結(jié)晶,因而降低存活率.

(5)保藏經(jīng)凍結(jié)至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器的小圓筒內(nèi),然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi).液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150℃,液態(tài)氮內(nèi)為-196℃.

(6)恢復(fù)培養(yǎng)保藏的菌種需要用時(shí),將安瓿管取出,立即放入38-40℃的水浴中進(jìn)行急劇解凍,直到全部融化為止.再打開安瓿管,將內(nèi)容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng).

    此法除適宜于一般微生物的保藏外,對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動物細(xì)胞均可長期保藏,而且性狀不變異.缺點(diǎn)是需要特殊設(shè)備.

6. 冷凍干燥保藏法

(1)準(zhǔn)備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造,形狀可用長頸球形底的,亦稱淚滴型安瓿管,大小要求外徑6-7.5mm,長105mm,球部直徑9-11mm,壁厚0.6-1.2mm.也可用沒有球部的管狀安瓿管.塞好棉塞,1.05kg/cm2>,121.3℃滅菌30分鐘,備用

(2)準(zhǔn)備菌種,用冷凍干燥法保藏的菌種,其保藏期可達(dá)數(shù)年至十?dāng)?shù)年,為了在許多年后不出差錯(cuò),故所用菌種要特別注意其純度,即不能有雜菌污染,然后在最適培養(yǎng)基中用最適溫度培養(yǎng),使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物.細(xì)菌和酵母的菌齡要求超過對數(shù)生長期,若用對數(shù)生長期的菌種進(jìn)行保藏,其存活率反而降低.一般,細(xì)菌要求24-48小時(shí)的培養(yǎng)物；酵母需培養(yǎng)3天；形成孢子的微生物則宜保存孢子；放線菌與絲狀真菌則培養(yǎng)7-10天.

(3)制備菌懸液與分裝以細(xì)菌斜面為例,用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中,制成濃菌液,每支安瓿管分裝0.2ml.

(4)冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售,價(jià)值昂貴,此處介紹的是簡易方法與裝置,可達(dá)到同樣的目的.

    將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍,無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰(固體CO2)酒精液或干冰丙酮液,溫度可達(dá)-70℃.將安瓿管插入冷凍劑,只需冷凍4~5分鐘,即可使懸液結(jié)冰.

(5)真空干燥為在真空干燥時(shí)使樣品保持凍結(jié)狀態(tài),需準(zhǔn)備冷凍槽,槽內(nèi)放碎冰塊與食鹽,混合均勻,可冷至-15℃.裝置儀器,安瓿管放入冷凍槽中的干燥瓶內(nèi).

    抽氣一般若在30分鐘內(nèi)能達(dá)到93.3Pa(0.7mmHg)真空度時(shí),則干燥物不致熔化,以后再繼續(xù)抽氣,幾小時(shí)內(nèi),肉眼可觀察到被干燥物已趨干燥,一般抽到真空度26.7Pa(0.2mmHg),保持壓力6~8小時(shí)即可.

(6)封口抽真空干燥后,取出安瓿管,接在封口用的玻璃管上,可用L形五通管繼續(xù)抽氣,約10分鐘即可達(dá)到26.7Pa(0.2mmHg).于真空狀態(tài)下,以煤氣噴燈的細(xì)火焰在安瓿管頸中央進(jìn)行封口.封口以后,保存于冰箱或室溫暗處.

    此法為菌種保藏方法中最有效的方法之一,對一般生活力強(qiáng)的微生物及其孢子以及無芽胞菌都適用,即使對一些很難保存的致病菌,如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存.適用于菌種長期保存,一般可保存數(shù)年至十余年,但設(shè)備和操作都比較復(fù)雜.