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      磺胺類總量ELISA檢測試劑盒說明書

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2009-03-04
      核心提示:一、概要 本試劑盒是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)的新一代藥物殘留檢測產(chǎn)品,與儀器分析技術(shù)相比具有快速、簡便、準(zhǔn)確和靈敏度高等特點(diǎn),操作時(shí)間僅需1.5小時(shí),能最大限度地減少工作強(qiáng)度和操作誤差。 二、試驗(yàn)原理 本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗

      一、概要
      本試劑盒是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)的新一代藥物殘留檢測產(chǎn)品,與儀器分析技術(shù)相比具有快速、簡便、準(zhǔn)確和靈敏度高等特點(diǎn),操作時(shí)間僅需1.5小時(shí),能最大限度地減少工作強(qiáng)度和操作誤差。

      二、試驗(yàn)原理
      本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,樣本中的殘留物磺胺間甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺噻唑與微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗三者的抗體,加入酶標(biāo)二抗后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其所含磺胺類藥物的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù),即可得出樣品中磺胺類藥物的殘留量。

      三、適用范圍
      可定性、定量檢測動(dòng)物組織(肌肉/肝臟/魚/蝦)、雞蛋、蜂蜜、牛奶、血清等樣品中磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺嘧啶(SD或SDZ)、磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺噻唑(ST)藥物的殘留量。

      四、交叉反應(yīng)率
      磺胺嘧啶(SD或SDZ)……………………………  100.0%
      磺胺間甲氧嘧啶/磺胺六甲氧嘧啶(SMM)…… 98%
      磺胺甲噁唑(SMZ)…………………………………  120.0%
      磺胺噻唑(ST)………………………………………  98.0%
      酞;青邕颍≒ST)…………………………………  62.8%
      磺胺甲噻二唑……………………………………  103%
      磺胺吡啶……………………………………………  51.9%
      磺胺對(duì)甲氧嘧啶…………………………… 35%

      五、使用單位需自備的設(shè)備及試劑
      設(shè)備:
      ┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm
      ┅┅旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮?dú)獯蹈裳b置
      ┅┅均質(zhì)器振蕩器、洗耳球、容量瓶:500ml
      ┅┅渦旋儀、離心機(jī)
      ┅┅天平:感量0.01g
      ┅┅刻度移液管:10ml
      ┅┅玻璃試管:15ml
      ┅┅聚苯乙烯離心管:50ml
      ┅┅玻璃離心管:10ml
      ┅┅微量移液器:單道 20ml~200ml、200ml~1000ml
      多道 250ml
      試劑:
      ----乙腈(分析純)(動(dòng)物組織專用)
      ----乙酸乙酯(分析純)
      ----正己烷(分析純)
      ----十二水合磷酸氫二鈉(分析純)
      ----二水合磷酸二氫鈉(分析純)
      ----氫氧化鈉(分析純)
      ----濃鹽酸
      ----去離子水

      六、提供的材料與試劑
      1、96孔酶標(biāo)板×1塊(包被有偶聯(lián)抗原)
      2、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶:(1ml/瓶)
      0ppb,2ppb,4ppb,8ppb,16ppb,32ppb
      3、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品:(1ml/瓶) 1ppm
      4、酶標(biāo)二抗         12ml …………………… 紅色帽
      5、抗體工作液       10ml …………………… 綠色帽
      6、底物液 A 液       7ml …………………… 白色帽
      7、底物液 B 液       7ml …………………… 紅色帽
      8、終 止 液          7ml …………………… 黃色帽
      9、20×濃縮洗滌液     40ml……………………… 透明帽
      10、20×濃縮提取液    50ml……………………… 藍(lán)色帽

      七、溶液的配制
       配液1: 0.02M磷酸鹽緩沖液
              稱取5.36g十二水合磷酸氫二鈉、0.2g二水合磷酸二氫鉀、8g氯化鈉和0.2g氯化鉀加去離子水溶解定容至1L
      配液2: 0.5 M鹽酸溶液
                量取41.7ml濃鹽酸加去離子水定容至500ml
      配液3: 0.2 M 氫氧化鈉        
                 稱取4g氫氧化鈉加去離子水定容至500ml
      配液4: 提取工作液
                 用去離子水將20×濃縮提取液按1:19體積比進(jìn)行稀釋(1份20×濃縮提取液+19份去離子水)用于樣本的提取,提取工作液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。
      配液5: 洗滌工作液
      用去離子水將20×濃縮洗滌液按1:19體積比進(jìn)行稀釋(或按需量稀釋)(1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水)用于酶標(biāo)板的洗滌,洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。

      八、樣本前處理步驟
      樣本處理前須知
      處理任何樣本時(shí),都必須注意:
      (a)實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭,在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。
         (b)實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈,必須使用潔凈實(shí)驗(yàn)器具,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果
         (c)所有樣本復(fù)溶后均不能保存
      (一) 高檢測限樣本
      (a )動(dòng)物組織(雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、雞蛋)
      ┅┅用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本;
      ┅┅稱取2.0±0.05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中,加入8ml乙腈,立即用振蕩器振蕩20min,3000g以上離心5min;
      ┅┅取上清液2ml至10ml干凈的玻璃試管中,于50~60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑?/div>
      ┅┅加入1ml正己烷用渦旋儀渦動(dòng)20s溶解干燥殘留物,加入1ml 0.02 M磷酸鹽緩沖液(見配液1),用渦旋儀渦動(dòng)1min,3000g以上離心10min;
      ┅┅除去上層正己烷相,取下層水相20ml用于分析。
      (b)動(dòng)物組織(魚、蝦)
      ┅┅用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本;
      ┅┅稱取2.0±0.05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中,加入2ml去離子水,用渦旋儀渦動(dòng)至糊狀,加入8ml乙腈,立即用振蕩器振蕩20min,3000g以上離心5min;
      ┅┅取上清液2.5ml至10ml干凈的玻璃試管中,于50~60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑?/div>
      ┅┅加1ml正己烷用渦旋儀渦動(dòng)20s溶解干燥殘留物,加入1ml 0.02 M磷酸鹽緩沖液(見配液1),用渦旋儀渦動(dòng)1min,3000g以上離心10min;
      ┅┅除去上層正己烷相,取下層水相20ml用于分析。
      (二)低檢測限樣本提取方法
      動(dòng)物組織(雞肉、雞肝、豬肉、豬肝)
      ┅┅用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本;
      ┅┅稱取2.0g±0.05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中,加入 10ml提取工作液,充分上下混合振蕩10min,再放入37℃恒溫箱,30min后取出,3000g以上,10℃離心10min;
      ┅┅取清亮上清20ml用于分析。
      (三)血清前處理方法
      ┅┅將血樣本于室溫放置30min,3000g以上,10℃離心10min,分離出血清或過濾血清;
      ┅┅取1ml血清至10ml干凈的玻璃試管中,加入3ml 0.02 M 磷酸鹽緩沖液(見配液1)混合均勻;
      ┅┅取20ml用于分析。
      (四)蜂蜜前處理方法
      ┅┅稱取1±0.05g蜂蜜樣本至50ml聚苯乙烯離心管中;
      ┅┅加入2ml 0.5 M鹽酸溶液(見配液2),用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解;
      ┅┅放入37℃培養(yǎng)箱中孵育30min;
      ┅┅加入5ml 0.2M氫氧化鈉(見配液3)(調(diào)pH值范圍為4~6)用振蕩器振蕩1min,再加入8ml乙酸乙酯,用振蕩器振蕩5min,3000g以上離心10min;
      ┅┅取上層液體至10ml干凈的玻璃試管中,于50~60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑?/div>
      ┅┅加1ml 0.02 M磷酸鹽緩沖液(見配液1)溶解;
      ┅┅取20ml用于分析
      (五)尿液前處理方法
      ┅┅將尿液于3000g以上,室溫(20-25℃)離心5min,直至尿液樣本清亮;
      ┅┅移取1ml清亮尿液至10ml干凈的玻璃試管中,加入3ml提取工作液混合;
      ┅┅取20ml用于分析。
       (六)牛奶前處理方法
      ┅┅取牛奶樣本,3000g以上,10℃離心10min,吸除上層脂肪;
      ┅┅移取1ml離心后的牛奶樣本至10ml干凈的玻璃試管中,加入0.02 M 磷酸鹽緩沖液(見配液1)按1︰19的體積比進(jìn)行稀釋(即20ml牛奶+380ml 0.02磷酸鹽緩沖液);
      ┅┅取20ml用于分析。

      九、檢測步驟
      測定前應(yīng)須知:
      1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫(20-25℃)。
      2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
      3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。
      4、在所有恒溫孵育過程中,避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。
      操作步驟:
      1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出,置于室溫(20-25℃)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
      2、取出需要數(shù)量的微孔板,將不用的微孔放入自封袋,保存于2-8℃。
      3、洗滌工作液在使用前也需回溫。
      4、編號(hào):將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
      5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本:加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20ml到對(duì)應(yīng)的微孔中,然后加抗體工作液80ml/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。
      6、洗板:小心揭開蓋板膜,將孔內(nèi)液體甩干,用洗滌工作液(見配液5)250ml/孔,充分洗滌4-5次,每次間隔10s,用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。
      7、加酶標(biāo)二抗:加酶標(biāo)二抗100ml/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)20min,取出重復(fù)步驟6。
      8、顯色:加入底物液A液50ml/孔,再加底物液B液50ml/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min(見注意事項(xiàng)8)。
      9、測定:加入終止液50ml/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,請(qǐng)?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)),測定每孔OD值。(若無酶標(biāo)儀,則不加終止液用目測法可進(jìn)行判定)。

      十、結(jié)果判定
      結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含磺胺類藥物的含量成負(fù)相關(guān)。
      1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.211,樣本2的吸光度值為0.785,標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是:0ppb為2.100;2ppb為1.680;4ppb為1.210;8ppb為0.580;16ppb為0.308;32ppb為0.120。則樣本1的濃度范圍是16ppb-32ppb再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中磺胺類藥物殘留的濃度范圍;樣本2的濃度范圍是4ppb-8ppb再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中磺胺類藥物殘留的濃度范圍。
      2、定量分析
      (1)百分吸光率的計(jì)算,標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100%,即
      百分吸光度值(%)=
      B
      ×100%
      B0
      B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
      B0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
      (2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
      以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),以磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中磺胺類藥物的實(shí)際濃度
      若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。(歡迎來電索取)
      樣本稀釋倍數(shù)
      組織樣品稀釋倍數(shù)
      高檢測限樣本:
      (a)方法處理肌肉/肝臟和雞蛋樣品稀釋倍數(shù):2
      (b)方法處理魚、蝦樣品稀釋倍數(shù):2
      低檢測限樣本
      肌肉/肝臟: 5
      血清樣品稀釋倍數(shù):4
      蜂蜜樣品稀釋倍數(shù):1
      尿樣樣品稀釋倍數(shù):4
      奶樣樣品稀釋倍數(shù):20

      十一、檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度
      試劑盒靈敏度:2ppb
      樣本最低檢測限:
      血清樣本/尿樣檢測下限…………………………………8ppb
      牛奶樣本檢測下限………………………………………40ppb
      組織樣本檢測下限
      高檢測限
      肌肉/肝臟和雞蛋……………………………………… 4ppb
      魚、蝦…………………………………………………… 4ppb
      低檢測限
      肌肉/肝臟………………………………………………10ppb
      準(zhǔn)確度:
      雞肉/肝、豬肉/肝……………………………………75±10%
      雞蛋…………………………………………………69±10%
      蜂蜜、牛奶、血清……………………………………70±10%
      精密度:
      試劑盒的變異系數(shù)均小于10%

      十二、注意事項(xiàng)
      1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫(20-25℃)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
      2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
      3、每加一種試劑前需要將其搖勻。
      4、反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。
      5、不要使用過了有效日期的試劑盒;也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑,摻雜使用過了有效期的試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低;不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
      6、儲(chǔ)存條件
      保存試劑盒于2-8℃,不要冷凍,將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。
      7、試劑變質(zhì)的跡象
      發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A450nm<0.5 )時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。
      8、在加入底物液A和底物液B液后,一般顯色20min即可。若顏色較淺,可延長反應(yīng)時(shí)間到25min(或更長),但不得超過30min。反之,則減短反應(yīng)時(shí)間。
      9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

      十三、貯藏條件及保存期
           貯藏條件:保存試劑盒于2~8℃。
      保存期:該產(chǎn)品有效期為12個(gè)月。

          北京祥龍環(huán)宇生物技術(shù)有限公司
          北京市朝陽區(qū)朝陽路財(cái)滿街財(cái)經(jīng)中心9號(hào)樓1單元702室 郵編100025
          電話 010-65567512   傳真010-65563420
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