一、概要
用來檢測呋喃妥因代謝物的最常用方法是LC-UV，LC-MS和LC-MS/MS。酶聯(lián)免疫方法結(jié)合了色譜技術(shù)，采用AHD衍生物的特異性抗體，具有很高的精確度和靈敏度，較低的操作技術(shù)要求和短暫的檢測時(shí)間，檢測樣本量大等特點(diǎn)在檢測中很好的表現(xiàn)出來。

二、試驗(yàn)原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物的AHD經(jīng)衍生化后和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗呋喃妥因代謝物的衍生物抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物AHD代謝物的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中呋喃妥因代謝物的殘留量。

三、適用范圍
 可定性、定量檢測動物組織（雞、豬、牛、魚、蝦等）、牛奶和蜂蜜中呋喃妥因代謝物的殘留量。

四、交叉反應(yīng)率
呋喃妥因代謝物…………………………………………100%
呋喃唑酮代謝物…………………………………小于0.1%
呋喃它酮代謝物…………………………………小于0.1%
硝基糠腙（呋喃西林）代謝物…………………小于0.1%
呋喃唑酮………………………………………………小于1%
呋喃它酮………………………………………………小于1%
呋喃妥因………………………………………………13%
呋喃西林…………………………………………小于1%

五、使用單位需自備的設(shè)備及試劑
設(shè)備：
┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm
┅┅旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮?dú)獯蹈裳b置
┅┅均質(zhì)器
┅┅振蕩器
┅┅渦旋儀
┅┅離心機(jī)
┅┅天平：感量0.01g
┅┅刻度移液管：10ml
┅┅洗耳球
┅┅容量瓶：100ml、1L
┅┅玻璃試管：10ml
┅┅聚苯乙烯離心管：50ml
┅┅微量移液器：單道 20ml～200ml、100ml～1000ml
多道 250ml
試劑：
┅┅乙酸乙酯(分析純)
┅┅正己烷（或正庚烷）(分析純)
┅┅三水合磷酸氫二鉀(分析純)
┅┅甲醇(分析純)
┅┅二水合亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）（分析純）（供奶樣用）
┅┅七水合硫酸鋅(ZnSO4·7 H2O) (分析純)（供奶樣用）
┅┅濃鹽酸
┅┅氫氧化鈉(分析純)
┅┅去離子水

六、提供的材料與試劑
1、96孔酶標(biāo)板×1塊 （包被有偶聯(lián)抗原）
2、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（1ml/瓶）
0ppb，0.1ppb，0.3ppb，0.9ppb，2.7ppb，8.1ppb
3、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：（1ml/瓶） 100ppb
4、酶標(biāo)二抗         12ml …………………… 紅色帽
5、抗體工作液       7ml …………………… 綠色帽
6、底物液 A 液       7ml …………………… 白色帽
7、底物液 B 液       7ml …………………… 紅色帽
8、終 止 液          7ml …………………… 黃色帽
9、20×濃縮洗滌液     40ml……………………… 透明帽
10、2×濃縮復(fù)溶液      50ml……………………… 藍(lán)色帽
11、2-硝基苯甲醛      15.1mg…………………… 黑色帽

七、溶液的配制
配液1: 衍生化試劑
          向裝有2-硝基苯甲醛的試劑瓶中加甲醇溶解定容至10ml（濃度為10mM）。
配液2: C液（供奶樣用）：
0.36M亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）溶液
             稱取12.5g 二水合亞硝基鐵氰化鈉加去離子水定容至100ml
      D液（供奶樣專用）：
1M硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）溶液
             稱取29.8g 硫酸鋅用去離子水定容至100ml
配液3: 0.1M 磷酸氫二鉀溶液
           稱取22.8g 三水合磷酸氫二鉀加去離子水定容至1L。
配液4: 1M鹽酸溶液     
           量取8.3ml濃鹽酸加去離子水定容至100ml。
配液5: 1M氫氧化鈉    
           稱取4.0g氫氧化鈉加去離子水定容至100ml。
配液6: 甲醇-水溶液
          量取甲醇90 ml加去離子水10 ml混勻。
配液7: 復(fù)溶工作液
用去離子水將2×濃縮復(fù)溶液按1：1體積比進(jìn)行稀釋（1份2×濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于提取樣本的復(fù)溶，復(fù)溶工作液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。
配液8: 洗滌工作液
用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19體積比進(jìn)行稀釋（1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水）用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。

八、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
處理任何樣本時(shí)，都必須注意：
（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。
   （b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必須使用潔凈實(shí)驗(yàn)器具，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果
（c）衍生化試劑可于2-8℃保存半年。
（d）未處理的樣本冷凍保存。
（e）處理好的樣本可在2-8℃避光保存24小時(shí)。
 （一）肌肉、肝臟、水產(chǎn)（魚蝦等）組織前處理方法
┅┅用均質(zhì)器均質(zhì)樣本
┅┅取1.0±0.05g的均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中；
┅┅加入5ml甲醇-水溶液（見配液6），用振蕩器振蕩5min，3000g以上離心10min，去除全部上清液；（本步驟可降低樣本基質(zhì)干擾）
┅┅加入4ml的去離子水，用渦旋儀渦動溶解，加入0.5ml 1M 鹽酸溶液（見配液4）和100ml 衍生化試劑（見配液1），用振蕩器充分振蕩；
┅┅接（四）描述方法（標(biāo) * 處）。
注：樣本應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存
 （二）牛奶前處理方法
┅┅取牛奶樣本，3000g以上，10℃離心10min，吸除上層脂肪；
┅┅取出5ml去除脂肪牛奶樣本至10ml玻璃離心管中；
┅┅分別加入250ml C液和250ml D液（見配液2）；
┅┅用振蕩器充分振蕩混合，3000g以上，4~12 oC（39-54℉）離心10min。如果沒有恒溫離心機(jī)，則先將樣本降溫至大約8 oC（46℉），然后離心；
┅┅取牛奶的離心上清液1.1 ml（相當(dāng)于1 ml奶樣），分別加入4ml的去離子水用振蕩器振蕩溶解，0.5ml 1M 鹽酸（見配液4）和100ml 衍生化試劑（見配液1），充分振蕩2min；
┅┅接（四）描述方法（標(biāo) * 處）。
（三）蜂蜜前處理方法
┅┅稱取1.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中；
┅┅加入4ml的去離子水，用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；
┅┅0.5ml 1M 鹽酸溶液（見配液4）和100ml 衍生化試劑（見配液1），用振蕩器充分振蕩；
┅┅接（四）描述方法（標(biāo) * 處）。
（四）接上面的方法
*┅┅在37 oC過夜孵育（大約16h）；
┅┅分別加入5ml 0.1M磷酸氫二鉀溶液（見配液6）、0.4ml 1M氫氧化鈉溶液（見配液5）和5ml的乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s；
┅┅3000g以上，室溫（20-25 oC/68-77℉）離心10min；
┅┅取2.5ml乙酸乙酯相至10ml干燥的玻璃試管中，于50～60℃氮?dú)饬飨麓蹈桑?br /> ┅┅用1ml的正己烷（或正庚烷）用渦旋儀渦動30s，再加入1ml復(fù)溶工作液（見配液7），用渦旋儀渦動1min充分混勻；
┅┅3000g以上，室溫（20-25 oC/68-77℉）離心10min；
┅┅除去上層有機(jī)相，取下層水相50µl用于分析。

九、檢測步驟
測定前應(yīng)須知：
1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。
2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。
4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
操作步驟：
1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
3、洗滌工作液在使用前也需回溫。
4、編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50ml 到對應(yīng)的微孔中，然后加入抗體工作液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。
6、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液（見配液8）250ml/孔，充分洗滌4－5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。
7、加酶標(biāo)二抗：加入酶標(biāo)二抗100ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min，取出重復(fù)洗板步驟6。
8、顯色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min（見注意事項(xiàng)8）。
9、測定：加入終止液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，請?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。(若無酶標(biāo)儀，則不加終止液用目測法可進(jìn)行判定)。

十、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與呋喃妥因代謝物的含量成負(fù)相關(guān)。
1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。例如樣本1的吸光度值為0.236，樣本2的吸光度值為0.666，標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值分別是： 0ppb為1.949；0.1ppb為1.434； 0.3ppb為.939； 0.9ppb為0.487； 2.7ppb為0.157； 8.1ppb為0.060。則樣本1的濃度范圍是0.9ppb-2.7ppb再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中呋喃妥因代謝物殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是0.3ppb-0.9ppb再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中呋喃妥因代謝物殘留的濃度范圍。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值（%）＝ B ×100%
 B0 
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以呋喃妥因代謝物標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃妥因代謝物的實(shí)際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）
樣本稀釋倍數(shù)
魚蝦和肌肉肝臟樣品稀釋倍數(shù)：2
奶樣樣品稀釋倍數(shù)：2
蜂蜜樣品稀釋倍數(shù)：2

十一、檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度
試劑盒靈敏度：0.1ppb
樣本最低檢測限：
組織、蜂蜜，牛奶樣品檢測下限………………………0.2ppb
蝦\魚等水產(chǎn)組織因存在一定的干擾，檢測下限在0.3ppb
準(zhǔn)確度：
水產(chǎn)、肌肉、肝臟組織 ……………………………  75±15%        
蜂蜜樣本 …………………………………………  90±15%
奶樣………………………………………………  90±10%
精密度：
試劑盒的變異系數(shù)均小于10%

十二、注意事項(xiàng)
1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、每加一種試劑前需要將其搖勻。
4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
6、儲存條件
保存試劑盒于2-8℃，不要冷凍，將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、試劑變質(zhì)的跡象
發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色10-15min即可。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時(shí)間到20min（或更長），但不得超過30min。反之，則減短反應(yīng)時(shí)間。
9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為37℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

十三、貯藏條件及保存期
     貯藏條件：保存試劑盒于2~8℃。
保存期：該產(chǎn)品有效期為12個(gè)月。

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