聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。其基本步驟是，首先將待擴增的模板DNA變性使之成為單鏈，DNA樣品中，特異性的引物能夠與其互補的序列雜交，在dNTPs和Taq酶存在時，就可以合成模板DNA的互補鏈，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物加熱使DNA雙鏈變性，溫度下降后，過量的引物又可以開始第二輪的合成反應(yīng)。這種延伸-變性-退火-延伸的循環(huán)可以重復(fù)多次，使所需要的DNA片段得到特異性的擴增。

PCR引物設(shè)計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。因此，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。

要設(shè)計引物首先要找到DNA序列的保守區(qū)。同時應(yīng)預(yù)測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結(jié)構(gòu)。如這個區(qū)域單鏈能形成二級結(jié)構(gòu)，就要避開它。如這一段不能形成二級結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計引物。

現(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設(shè)計一對引物。一般引物長度為15~30堿基，擴增片段長度為100~600堿基對。讓我們先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%。而且四種堿基的分布最好隨機。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P1引物設(shè)計的就不合理。應(yīng)重新尋找區(qū)域設(shè)計引物。同時引物之間也不能有互補性，一般一對引物間不應(yīng)多于4個連續(xù)堿基的互補。

引物確定以后，可以對引物進行必要的修飾，例如可以在引物的5′端加酶切位點序列；標記生物素、熒光素等，這對擴增的特異性影響不大。但3′端絕對不能進行任何修飾，因為引物的延伸是從3′端開始的。這里還需提醒的是3′端不要終止于密碼子的第3位，因為密碼子第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。

綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設(shè)計原則：

①引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。

②產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。

③引物長度一般在15~30堿基之間。

④G+C含量在40%~60%之間。

⑤堿基要隨機分布。

⑥引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。

⑦引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。

⑧引物5′端可以修飾。

⑨引物3′端不可修飾。

⑩引物3′端要避開密碼子的第3位。