色譜填料的選擇 

一、硅膠基質填料

硅膠是HPLC填料最普遍的基質。除了具有無機物基質共有的高強度，還提供了一個表面，可以通過成熟的硅烷化技術鍵合范圍很廣的配基，制成反相、離子交換、疏水作用、親水作用或分子排阻色譜。硅膠基質填料適用廣泛的溶劑，從極性到非極性。其缺點是在水溶性堿性流動相中不穩(wěn)定。通常，硅膠基質的填料推薦的常規(guī)分析pH范圍為2～8。

1、正相色譜

正相色譜用的固定相通常為硅膠(Silica)以及其它具有極性官能團,如胺基團(NH2,APS)和氰基團(CN,CPS)的鍵合相填料。由于硅膠表面的硅羥基(SiOH)或其它極性基團極性較強，因此，分離的次序是依據樣品中各組份的極性大小，即極性較弱的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如：正己烷(Hexane)、氯仿(Chloroform)、二氯甲烷(Methylene Chloride)等。

2、反相色譜

反相色譜用的填料常是以硅膠為基質，表面鍵合有極性相對較弱的官能團的鍵合相。反相色譜所使用的流動相極性較強，通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強的組份最先被沖洗出，而極性弱的組份會在色譜柱上有更強的保留。

常用的反相填料有：C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。

二、聚合物填料

聚合物填料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其優(yōu)點是在pH值為1～14均可使用。相對于硅膠基質的C18填料，這類填料具有較強的疏水性，而且大孔的聚合物對蛋白質等樣品的分離非常有效。其缺點是相對硅膠基質填料，色譜柱柱效較低。

三、其它無機填料

其它HPLC的無機填料色譜柱也已經商品化由于其特殊的性質，一般僅限于特殊的用途。如，石墨化碳黑正逐漸成為反向色譜柱填料。這種填料的分離不同于硅膠基質烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎，不再需其它的表面改性。該柱填料一般比烷基鍵合相硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強。石墨化碳可用于分離某些幾何異構體，由于在HPLC流動相中不會被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可以用于HPLC。氧化鋁微粒剛性強，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點是可以在pH高達12的流動相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物的作用也很強，應用范圍受到一定限制，所以未能廣泛應用。新型色譜氧化鋯基質填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應用pH1～14，溫度可達100℃。由于氧化鋯填料是最近幾年才開始研究，加之面臨的實驗難度，其重要用途與優(yōu)勢尚在進行之中。

填料粒度的選擇

目前，高效液相色譜柱廠家色譜填料粒度從1 um到超過30 um均有銷售，而目前分析分離主要用3和5 um填料進行。填料的粒度主要影響 填充柱的兩個參數，即柱效和背壓。粒度越小，柱壓越大，柱壓的增加限制了粒度小于3 um的填料應用。在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是唯 一的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近 30%；然而，3um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍。與此同時，柱效提高意味著在相同條件下可以選用更短的色譜柱，即相同的塔板數或分離能力，但是柱長 更短，以縮短分析時間。另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。

液相色譜柱的使用

色譜柱在使用前，最好進行柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測得的結果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。

1、樣品的前處理

最好使用流動相溶解樣品。

使用預處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不可逆吸附的雜質。

使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質。

2、流動相的配制

液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：

§ 

流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長期留在柱中)。

流動相與樣品不產生化學反應。

流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。

流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。

流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡，導致實驗無法進行。

在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用