在色譜分析過(guò)程中常常需要使用緩沖鹽來(lái)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值,緩沖鹽的不當(dāng)使用對(duì)色譜柱可能造成柱壓升高、柱效下降以及使化合物的保留時(shí)間發(fā)生變化等影響。
那么,這些問(wèn)題該如何解決呢?
1)柱壓升高
緩沖鹽使用不當(dāng)導(dǎo)致緩沖鹽析出,堵塞塞板和鍵合相顆粒之間的孔隙,阻礙流動(dòng)相傳質(zhì),引起柱壓升高
2)相同化合物的保留時(shí)間發(fā)生變化
如果沒(méi)有沖洗干凈就進(jìn)行進(jìn)樣,色譜柱內(nèi)含有的鹽會(huì)使化合物的保留時(shí)間發(fā)生變化
3)柱效下降
i)有些緩沖鹽會(huì)滲入到鍵合相的深處,損害硅膠基體,導(dǎo)致色譜柱鍵合相流失,柱床變松,柱效下降
ii)凝結(jié)在鍵合相表面,使C18碳鏈難以舒展,對(duì)物質(zhì)的保留能力下降,導(dǎo)致柱效下降。因此用過(guò)緩沖鹽后需要對(duì)色譜柱進(jìn)行沖洗,水中緩沖鹽濃度較大時(shí)應(yīng)特別引起注意
流動(dòng)相中緩沖鹽的正確使用方法
在使用緩沖鹽作流動(dòng)相之前需要用不含緩沖鹽的流動(dòng)相沖洗色譜柱,直至基線平穩(wěn)。原則上,用于沖洗的流動(dòng)相與分析時(shí)所用的流動(dòng)相含水的比例相同(或含水更多),不同的只是用于沖洗用的流動(dòng)相中不含緩沖鹽。理由:緩沖鹽通常易溶于水,難溶于有機(jī)溶劑。用含緩沖鹽的(特別是做流動(dòng)相的水為飽和的緩沖鹽溶液時(shí))流動(dòng)相進(jìn)行分析時(shí),如果分析前色譜柱中用于保存色譜柱的流動(dòng)相中含水的比例相對(duì)較小,不先沖洗掉,接下來(lái)做樣品的時(shí)候所用的流動(dòng)相中如果有機(jī)溶劑含量大,而其比例中所含的水又不足以溶解該緩沖鹽時(shí),緩沖鹽將會(huì)在色譜柱柱體上析出,沉積下來(lái),這將可能導(dǎo)致上述對(duì)色譜柱的損害。
01使用前的處理:
在使用緩沖鹽作流動(dòng)相之前需要用不含緩沖鹽的流動(dòng)相沖洗色譜柱,直至基線平穩(wěn)。原則上,用于沖洗的流動(dòng)相與分析時(shí)所用的流動(dòng)相含水的比例相同(或含水更多),不同的只是用于沖洗用的流動(dòng)相中不含緩沖鹽。理由:緩沖鹽通常易溶于水,難溶于有機(jī)溶劑。用含緩沖鹽的(特別是做流動(dòng)相的水為飽和的緩沖鹽溶液時(shí))流動(dòng)相進(jìn)行分析時(shí),如果分析前色譜柱中用于保存色譜柱的流動(dòng)相中含水的比例相對(duì)較小,不先沖洗掉,接下來(lái)做樣品的時(shí)候所用的流動(dòng)相中如果有機(jī)溶劑含量大,而其比例中所含的水又不足以溶解該緩沖鹽時(shí),緩沖鹽將會(huì)在色譜柱柱體上析出,沉積下來(lái),這將可能導(dǎo)致上述對(duì)色譜柱的損害。
用與分析時(shí)含水比例相同的流動(dòng)相(與分析用流動(dòng)相唯一的區(qū)別是,用于沖洗的流動(dòng)相不含緩沖鹽)進(jìn)行沖洗約30min,直至基線平穩(wěn)。如果該色譜柱在接下來(lái)很長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)不使用,要長(zhǎng)期保存,則需再加上一步,即用純的有機(jī)溶劑沖洗一遍,直至基線平穩(wěn)。
02使用后的處理:
用與分析時(shí)含水比例相同的流動(dòng)相(與分析用流動(dòng)相唯一的區(qū)別是,用于沖洗的流動(dòng)相不含緩沖鹽)進(jìn)行沖洗約30min,直至基線平穩(wěn)。如果該色譜柱在接下來(lái)很長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)不使用,要長(zhǎng)期保存,則需再加上一步,即用純的有機(jī)溶劑沖洗一遍,直至基線平穩(wěn)。
使用緩沖液要注意幾點(diǎn)
1:避免使用鹽酸鹽,鹽酸鹽對(duì)鋼質(zhì)有腐蝕作用。
2:緩沖液最好要現(xiàn)配現(xiàn)用,往往緩沖液是良好的菌類培養(yǎng)液,隔天或放置長(zhǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)時(shí)會(huì)有很多怪現(xiàn)象發(fā)生。
3:實(shí)驗(yàn)后不可用有機(jī)溶劑直接過(guò)度,有機(jī)溶劑會(huì)使鹽類析出,造成液路或色譜柱堵塞,可用95:5的水甲醇沖洗。
4:使用緩沖液要及時(shí)掌握ph范圍,做到胸中有數(shù)。
5:清洗液路和柱子時(shí),有溫控可加熱到30攝氏度易于沖洗。
6:長(zhǎng)時(shí)間用緩沖溶液要注意觀察接頭處有無(wú)析出,若有白色鹽類析出,可考慮一定周期用10%硝酸沖洗一下液路(拆下柱子,走30ml,再用5倍水沖洗)可以避免液路的堵塞。
7:選擇緩沖液要用可靠的試劑,避免不純的鹽類造成不必要的麻煩。
如果流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例很高是不能用來(lái)沖洗緩沖鹽的,是洗不出來(lái)的。
通常C18柱先用5%~10%的甲醇沖洗,是可以把緩沖鹽沖洗出來(lái)的,然后用純的有機(jī)溶劑來(lái)保護(hù)柱子。最好的方法是使用與流動(dòng)相相同濃度不含鹽的流動(dòng)相進(jìn)行清洗。但就是速度慢一些。用水是為了快速替換,一般在15分鐘以內(nèi)最好,且用0.8的流速較好. 如果用純水沖,容易造成鍵合的碳鏈的流失,最好用5%~10%甲醇水溶液沖?梢杂眉兯媪鲃(dòng)相中的緩沖液,有機(jī)相不變。這樣沖洗柱子比較穩(wěn)妥。
色譜柱異常及解決辦法
柱壓與硅膠基質(zhì)的形態(tài)(如無(wú)定形或球形硅膠)、顆粒大小、填料合成條件、裝柱條件、所用流動(dòng)相和分析時(shí)的溫度有關(guān)。不同廠家的色譜柱柱壓會(huì)有所差別,相同流動(dòng)相和溫度的條件下,不同廠家的新色譜柱有的柱壓可能相差4、5個(gè)MPa,特別是低端和高端色譜柱之間,這一區(qū)別比較明顯。這是由色譜柱廠家所選用的硅膠基質(zhì)及其生產(chǎn)條件決定的,這種差異的存在是正常的。同時(shí)需要說(shuō)明的一點(diǎn)是,柱壓與柱效有一定的關(guān)系,通常柱效高的色譜柱柱壓相對(duì)而言會(huì)高一點(diǎn),但柱壓高的色譜柱并不一定就具有高柱效。
在色譜柱的使用過(guò)程中柱壓通常會(huì)出現(xiàn)兩種升高的形式:
隨著使用時(shí)間的延長(zhǎng)色譜柱柱壓慢慢上升,這是正常的
使用過(guò)程中(流動(dòng)相和溫度沒(méi)有改變的條件下)色譜柱壓力突然升高很多。這種壓力突然升高的現(xiàn)象,通常是由工作人員操作不當(dāng)引起的
1)樣品太臟,使用前沒(méi)有過(guò)濾,導(dǎo)致柱篩板堵塞
2)樣品含有的雜質(zhì)在流動(dòng)相中的溶解性不是很好,與流動(dòng)相混合后析出,導(dǎo)致柱塞板堵塞
3)使用緩沖鹽,處理錯(cuò)誤,緩沖鹽在色譜柱中析出,堵塞塞板和鍵合相顆粒之間的孔隙
原因:
1)樣品太臟,使用前沒(méi)有過(guò)濾,導(dǎo)致柱篩板堵塞
2)樣品含有的雜質(zhì)在流動(dòng)相中的溶解性不是很好,與流動(dòng)相混合后析出,導(dǎo)致柱塞板堵塞
3)使用緩沖鹽,處理錯(cuò)誤,緩沖鹽在色譜柱中析出,堵塞塞板和鍵合相顆粒之間的孔隙
對(duì)于第二種,即柱壓突然升高的情況,通常有以下幾種解決辦法:
1)將色譜柱反接,用含水比例較大的流動(dòng)相進(jìn)行沖洗。
2)色譜柱進(jìn)樣一端的篩板取下,分別放在水中和甲醇中超聲或更換新的柱篩板。如果柱效沒(méi)變,但柱壓仍然較高,則應(yīng)考慮進(jìn)樣端填料受污染的問(wèn)題,因此除了取下進(jìn)樣端篩板超聲外,還需要挖掉進(jìn)樣端的部分填料,挖去填料之前先檢查一下填料的顏色,如果填料的顏色發(fā)生了變化,則應(yīng)該挖掉直到見(jiàn)到白色的填料為止。
挖掉后色譜柱將出現(xiàn)一個(gè)缺口,填補(bǔ)缺口的填料可以從另一支相同品牌、相同型號(hào)的報(bào)廢色譜柱的出口端獲得,填料用有機(jī)溶劑如甲醇等調(diào)成糊狀裝入缺口處,壓緊刮平,再裝上篩板。
解決方法:
1)將色譜柱反接,用含水比例較大的流動(dòng)相進(jìn)行沖洗。
2)色譜柱進(jìn)樣一端的篩板取下,分別放在水中和甲醇中超聲或更換新的柱篩板。如果柱效沒(méi)變,但柱壓仍然較高,則應(yīng)考慮進(jìn)樣端填料受污染的問(wèn)題,因此除了取下進(jìn)樣端篩板超聲外,還需要挖掉進(jìn)樣端的部分填料,挖去填料之前先檢查一下填料的顏色,如果填料的顏色發(fā)生了變化,則應(yīng)該挖掉直到見(jiàn)到白色的填料為止。
挖掉后色譜柱將出現(xiàn)一個(gè)缺口,填補(bǔ)缺口的填料可以從另一支相同品牌、相同型號(hào)的報(bào)廢色譜柱的出口端獲得,填料用有機(jī)溶劑如甲醇等調(diào)成糊狀裝入缺口處,壓緊刮平,再裝上篩板。
柱子使用經(jīng)驗(yàn)
色譜柱在使用前,最好進(jìn)行柱的性能測(cè)試,并將結(jié)果保存起來(lái),作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。
但要注意:柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同;另外,在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是最佳條件),只有這樣,測(cè)得的結(jié)果才有可比性。
a、最好使用流動(dòng)相溶解樣品
b、使用預(yù)處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
c、使用0.45μm的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)
01樣品的前處理:
a、最好使用流動(dòng)相溶解樣品
b、使用預(yù)處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
c、使用0.45μm的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)
流動(dòng)相的選擇
a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力,保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中)
b、流動(dòng)相具有一定惰性,與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)
c、流動(dòng)相的黏度要盡量小,以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果;同時(shí)降低柱壓降,延長(zhǎng)液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)
d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器,最好使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制
e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低,否則容易產(chǎn)生氣泡,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行
f、在流動(dòng)相配制好后,一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè),還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用
02流動(dòng)相的配制:
a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力,保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中)
b、流動(dòng)相具有一定惰性,與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)
c、流動(dòng)相的黏度要盡量小,以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果;同時(shí)降低柱壓降,延長(zhǎng)液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)
d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器,最好使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制
e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低,否則容易產(chǎn)生氣泡,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行
f、在流動(dòng)相配制好后,一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè),還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用
03流動(dòng)相流速的選擇:
因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù),使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱,要追求最佳柱效,最好使用最佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱,流速一般選擇1ml/min,對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱,流速0.8ml/min為佳。當(dāng)選用最佳流速時(shí),分析時(shí)間可能延長(zhǎng)。可采用改變流動(dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí),可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)
a.由于甲醇廉價(jià),對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場(chǎng)合除外)。
b.對(duì)于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相,沒(méi)有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水(電阻率大于18兆歐),去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì),有可能影響分析結(jié)果。
c.含水流動(dòng)相最*在實(shí)驗(yàn)前配制,尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜。最好加入疊氮化鈉,防止細(xì)菌生長(zhǎng)。
d.流動(dòng)相要求使用0.45 μm濾膜過(guò)濾,除去微粒雜質(zhì)。
e.使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相,使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命,提高柱性能。
沖柱子的目的
只要是有機(jī)溶劑就行,不過(guò)黏度不要太大,因?yàn)橛袡C(jī)溶劑能夠防止細(xì)菌生長(zhǎng),沖柱子的目的就是為了防止細(xì)菌生長(zhǎng)堵塞儀器系統(tǒng)和柱子。一般甲醇和乙腈相互沖洗是沒(méi)有問(wèn)題的,但乙腈要比甲醇價(jià)格貴的 。
保留時(shí)間變化的原因
柱頭塌陷
在使用過(guò)程中,填料下沉,在柱子進(jìn)口處出現(xiàn)一個(gè)小空間,使得分離效果不良。
卸開柱頭螺絲,找一點(diǎn)同類填料,用甲醇濕潤(rùn)后,添在柱子上,反復(fù)幾次。然后裝上螺絲,用溶劑沖洗1-2小時(shí),使之平衡。
小結(jié)
正確使用緩沖鹽很有必要,既可以防止緩沖鹽析出,也可以達(dá)到提高色譜柱使用壽命的目的。
我們不妨用一句話來(lái)總結(jié)它的使用方法:用前要過(guò)濾,用后需沖洗。