適用范圍：

本思路僅適用于反向色譜法分析離子化合物方法開發(fā)中流動相pH的確定。

在反相色譜分析中通常不要求化合物精確的pKa值，我們可以通過查閱文獻以或者根據(jù)化合物的結構按照下圖中列出的主要酸堿官能團在水溶液的pKa值進行推測。

注意：按照上表中官能團進行估算時分子中相鄰基團的不同會導致pKa出現(xiàn)1-2個單位的差異。對于酸性化合物，當含有吸電子基團時會導致酸性增強，pKa值相應降低；對于堿性化合物，當含有吸電子基團時會導致堿性降低，pKa值相應降低。

先看下流動相pH對酸堿化合物的影響：

1.流動相pH對不同pKa化合物的保留時間的影響

請仔細觀察上圖，通過該圖我們可以獲得以下信息：

(1)調節(jié)流動相pH可改變離子化合物的保留

強酸及弱酸性化合物在酸性條件下會以分子形式存在，此時疏水性較高（極性大）在RPC的保留會較強。強堿及弱堿性化合物在堿性條件下多以分子形式存在，此時疏水性較高（極性大）在RPC的保留會較強。而中性化合物的保留基本與pH沒有關系，不隨pH的改變發(fā)生保留時間的變動。因此我們在方法開發(fā)的時候可以通過改變流動相的pH進行改變化合物的保留時間

(2)在pH3-9范圍內(nèi)微小的pH變化可能會引起保留時間的明顯變化，因此建議方法開發(fā)初始pH調節(jié)范圍在2～3，這樣可以降低對pH略微變化的敏感性。

(3)如果是未知的化合物，調節(jié)pH值我們可以根據(jù)保留時間的變化推斷化合物的酸堿性，比如保留時間隨著pH的增大而延長的樣品肯定是堿性化合物。

2.流動相pH對化合物峰型的影響

根據(jù)流動相pH對酸堿化合物的電離的影響，當化合物的pKa與流動相pH重合時會導致分子與離子形式共存，化合物的峰型不好。因此建議將pH控制在化合物的pKa±2的范圍以外，此時化合物99%基本是以分子或者離子形式存在，峰型會更加的尖銳。

3.流動相pH對化合物的選擇性的影響

根據(jù)這幅圖，我們可以看出，當流動相的pH約等于化合物的pKa時，可以最大限度的調整化合物的保留時間。此時改變0.1個單位的pH可以使得保留因子k變化10%，可引起分離度±2.5個單位的變動。但此時需要進行精確控制流動相的pH，這要求把流動相pH控制在0.02個單位以內(nèi)，在實驗室很難控制，重現(xiàn)性較差，成為分析的瓶頸。

但我們實驗時可以將pH范圍放寬，只要將流動相pH控制在化合物pKa值±1.5個單位的范圍內(nèi)（上圖所示的II范圍內(nèi)）就可以對化合物保留行為產(chǎn)生比較明顯的影響，此時進行分離選擇性較好。同時為了更好地控制保留行為的重現(xiàn)性，需要控制緩沖液的pH在±0.1個單位以內(nèi)(當流動相pH控制范圍較窄時建議使用緩沖鹽的質量進行控制，比pH計進行控制效果更優(yōu))。

通過以上三點分析我們可以得出，待分析化合物的pKa與確定流動相的pH有很大的關系。主要依據(jù)化合物出峰時間、化合物的峰型及所需要分離目標的化合物綜合考慮來確定流動相的pH。

可能有的同事會發(fā)現(xiàn)第二點和第三點是有些矛盾的，這時候就需要對自己的實驗進行初步的探索，看看是否pH值會對化合物的峰型產(chǎn)生影響（有的專家認為該觀點缺乏理論和實踐的支持）或者是否需要準確調節(jié)pH在化合物pKa±1.5范圍內(nèi)進行提高選擇性。

筆者在做實驗時發(fā)現(xiàn)有的物質會因稀釋液pH使用不當產(chǎn)生峰分叉的現(xiàn)象，調節(jié)稀釋液的pH即可解決峰的分叉；有時流動相pH在化合物的pKa±2的范圍內(nèi)時離子化合物并沒有出現(xiàn)峰分叉、峰型不好現(xiàn)象。

1.緩沖液選擇主要依據(jù)：

（1）緩沖溶液的pKa和緩沖容量

（2）溶解度

（3）紫外吸收

2.對以上三點進行說明

(1)一般緩沖溶液的pKa值與流動相的pH相等時緩沖能力最大，pKa與流動相的pH相差越大，緩沖液的緩沖能力越差。一般要求流動相的pH與緩沖液的pKa值不能超過±1.0個單位，當緩沖溶液濃度較高時可以放寬范圍到1.5個單位。常用的緩沖液的緩沖范圍見下圖：

緩沖溶液的濃度一般在5-50mmol，因過低導致緩沖能力不足（可通過調整進樣體積查看化合物峰型的變化，如果出現(xiàn)拖尾或者前沿現(xiàn)象，說明緩沖溶液的能力不足）；緩沖液濃度過大會導致與有機相混溶時鹽的析出，對儀器、色譜柱都會產(chǎn)生損傷，而且使得基線不好。一般初始摸索方法時推薦使用25mmol。

（2）根據(jù)緩沖液溶解度：在酸性緩沖溶液中，如磷酸鹽，緩沖液溶解度順序：鈉鹽＜鉀鹽＜銨鹽；有研究發(fā)現(xiàn)，當pH=7時10mmol的磷酸鉀在85%甲醇或者75%乙腈中可以溶解，在pH=3時，在85%甲醇或者85%乙腈中可以完全溶解（此測試通過使用容器將不同比例的混合溶劑進行混合，觀察大約30min，是否有沉淀產(chǎn)生，否則就要降低緩沖液的濃度或者有機相的含量，在梯度洗脫時尤為注意）。

（3）根據(jù)化合物的吸收波長：在pH≤3.5，6.0≤pH≤8.5或者pH≥11.0磷酸鹽緩沖液是不錯的選擇。而甲酸鹽和乙酸鹽緩沖液的范圍是2.5～6.0，適用于210納米或者更高吸收的檢測波長

3. 緩沖鹽的作用：

緩沖鹽的種類或者濃度對選擇性的改變會很小，只是起到緩沖作用，提高化合物的保留時間的穩(wěn)定性。

以上就是方法開發(fā)中流動相pH確定的主要基本思路。筆者在做實驗發(fā)現(xiàn)這些理論上的知識我們可能已經(jīng)知道了，但是在運用到方法開發(fā)的時候并不是一帆風順的。比如說我們最近做的一個苯胺類化合物，推測其為堿性，想象中改變流動相的pH應該會發(fā)生保留的變化，但是我們從酸性調節(jié)到堿性該化合物的保留卻沒有變動，后來我們分析可能是因該化合物有較強的吸電子基團導致堿性降低變成一個接近中性的物質，故保留時間不再受pH的影響。

筆者相信在方法開發(fā)時努力嘗試使用理論知識去指導實踐最終一定會取得較好的結果，而且會事半功倍。有時候理論無法去指導實踐可能是因為我們的理論知識層面還沒達到，有些地方可能沒有注意到有其它條件的影響。但只要我們一直堅持使用知識去指導實踐，通過實踐來驗證所學的知識，反復的相融合，不斷的總結，落實到書面上，我們在方法開發(fā)時一定會越來越順手。