1.CT值比較靠后，對實驗有一定的影響，因為經(jīng)過那么多次的循環(huán)，酶的活性有可能有所下降，這時候擴增效率會有所改變（而定量 PCR 的理論基礎(chǔ)就是每次循環(huán)的擴增效率我們認(rèn)為是確定的一個值）。因此最好能夠把CT 值往前移。

解決辦法可以將模板加以濃縮或者抽干之后用少量水去溶解。

2. 為什么合成的引物做不加摸板的對照也能擴增出目的條帶，而內(nèi)參用同樣體系就沒有呢?

引物被污染。

3. 實時定量 PCR，熒光定量 PCR，實時熒光定量 PCR，real－time PCR，這些是不是同一個概念？

是一個概念。

4. 我的標(biāo)準(zhǔn)曲線的 slope 總是大于４，而且每個梯度的平行 ct 值差別比較大，原因？

這個斜率是＝1/LOG 10(擴增效率)，理論上擴增效率＝2，斜率是 3.322。如果斜率大于 4，說明擴增效率比較小�？梢钥疾橐幌路磻�(yīng)體系是否合理？酶活是否正常？

平行管的 CT 值差別大可以考查一下自己實驗操作是否規(guī)范，另外一種原因就是儀器本身的誤差也可能會導(dǎo)致 CT 值差別比較大。

當(dāng)斜率為 4 的時候，擴增效率是 77.8%，斜率大于 4 的話，效率繼續(xù)下降。

擴增效率的問題實際就是引物的擴增效率，可能酶活的關(guān)系沒有那么重要，前提是試劑盒的質(zhì)量有保證�；氐綌U增效率，只有在引物和模板處于最適比例時才能得到比較滿意的擴增效率，因此通過調(diào)節(jié) PCR 反應(yīng)體系中的引物終濃度來解決，可以做一些引物梯度來比較。

5. ROX 染料是什么作用？

ROX 的作用 ABI 宣稱是用來校準(zhǔn)加樣誤差的。但是據(jù)說 ROX 的作用實際上是用來校準(zhǔn)光程差的。即每個孔的熒光信號經(jīng)過濾光片在經(jīng)過聚焦到CCD的時候，走過的光程是不一樣的，這樣在 CCD 上成像的亮度就不一樣了。所以需要把這個差異用 ROX 來計算孔間差異有多大，然后差異系數(shù)去處理，實際的熒光信號。

6. 熒光定量PCR的基線，是怎么確定的呢？

基線就是背景值，因此就是曲線在沒有“起跳”之前的一段。在軟件上有一個地方可以輸入 baseline 從第幾到第幾 cycle 作為基線。設(shè)置原則是使沒有起跳之前最多的 cycle 的信號接近0.

7. 熔解曲線出現(xiàn)多峰 (較為理想的熔解曲線是單峰曲線)

非特異性擴增

引物設(shè)計不夠優(yōu)化：根據(jù)設(shè)計原則設(shè)計新引物�？赏ㄟ^梯度 PCR 對引物退火溫度進(jìn)行優(yōu)化;

出現(xiàn)引物二聚體引物設(shè)計不合理而導(dǎo)致的引物二聚體在熔解曲線內(nèi)峰值一般位于 75℃左右，如該峰顯著請按照以下方面進(jìn)行優(yōu)化：

A.優(yōu)化擴增條件，如提高退火溫度，可利用梯度 PCR，摸索最佳的 Tm 值。通常兩步循環(huán)(由 95℃變性步驟直接進(jìn)入 60℃退火和延伸步驟) 有利于強效擴增，因此引物設(shè)計時設(shè)定的成功退火溫度為 60°C。

B.引物濃度太高，適當(dāng)降低引物濃度。通常引物的 Tm 低于目的基因，熔解曲線上峰值在目的基因峰的左邊。大多數(shù)情況下，每條引物的理想最終濃度為 200 nM，但如有需要，可將濃度降至 60 nM。

C.可通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)引物二聚體。引物二聚體在凝膠的底部形成擴散條帶，通常位于 100 bp 以下。在 PCR 過程中，二聚體的形成與模板的退火及延伸之間存在競爭作用。引物二聚體通常隨模板的減少而增加。單獨采用凝膠電泳分析進(jìn)行驗證的缺點在于，其靈敏度最低僅達(dá)到納克級，因此可能無法得出結(jié)果。凝膠電泳分析的優(yōu)勢是當(dāng)解離曲線(熔解曲線) 數(shù)據(jù)同時可用時，產(chǎn)物的大小有助于對結(jié)果進(jìn)行綜合解釋;cDNA 模板帶有基因組污染：重新制備 cDNA 模板。

8. 擴增曲線形狀異常，如“S”型曲線

• 反應(yīng)體系引起的擴增曲線不光滑---擴增效率偏差（過高或過低）

A. 擴增效率過高

出現(xiàn)非特異擴增或引物二聚體：反應(yīng)體系內(nèi)模板濃度太高以及模板核酸質(zhì)量較差（例如，如果采用硅膠柱純化時，結(jié)合 DNA 或 RNA 的離液鹽可抑制 Taq DNA 聚合酶。如果采用有機萃取法，則苯酚和乙醇?xì)堄辔镆簿哂邢嗤�的效�?yīng)），可能導(dǎo)致出現(xiàn)抑制 PCR 反應(yīng)的現(xiàn)象。在絕對定量時表現(xiàn)擴增效率大于 110%。

解決方案：

1）去除模板濃度最高的反應(yīng)孔并重新分析標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果效率重新回到 110% 以下，則分析良好；

2）對目的基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線，一般用克隆的該基因的質(zhì)粒做梯度稀釋，或用 PCR 產(chǎn)物做梯度稀釋，然后做定量擴增，通過曲線評估反應(yīng)效率。絕對定量有效的擴增效率在 90%-110%;

3）重新純化模板，去除模板中存在的潛在抑制物。切記應(yīng)延長干燥時間，以去除乙醇沉淀過程中的乙醇，或采用另外的純化柱加入洗滌液將離液鹽從硅膠純化物中去除。

B. 擴增效率過低

擴增效率過低主要表現(xiàn)在試劑濃度不適（主要是引物、鎂和 Taq DNA 聚合酶，尤其是在多重實驗中），引物對 Tm 之間的差異超過 5°C 以及熱循環(huán)條件不適，試管中各種同源物質(zhì)的競爭作用可造成反應(yīng)效率低下。絕對定量表現(xiàn)：擴增效率＜90%。解決方案：對上述因素逐一排除后進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化實驗體系。

C. 個別擴增曲線異常

如個別擴增曲線突然驟降：反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡，由于溫度升高后氣泡破裂，使儀器檢測到的熒光值突然降低所致。進(jìn)行擴增反應(yīng)之前要仔細(xì)檢查反應(yīng)管內(nèi)是否有氣泡殘留

1）儀器設(shè)置不當(dāng)引起的曲線異常

基線設(shè)置不當(dāng)，如擴增曲線斷裂或下滑：基線的終點值大于 Ct 值。減小基線終點 (Ct值- 4)，重新分析數(shù)據(jù); 基線范圍和閾值設(shè)置不當(dāng)�；�線范圍和閾值都是人為設(shè)定的參數(shù)。二者一般由儀器自動默認(rèn)為合適值。在對同一程序中的多種試劑盒或化學(xué)劑進(jìn)行評估時，經(jīng)常出現(xiàn)閾值設(shè)置不當(dāng)造成不同組別數(shù)據(jù)的擴增曲線差異：軟件自動選擇的閾值更適合平臺更高的曲線 (下圖中的藍(lán)色曲線)，這將導(dǎo)致此數(shù)據(jù)組中的紅色曲線的 Ct 值出現(xiàn)偏差，因為其最佳閾值比此值更低。因此，需對每個數(shù)據(jù)組進(jìn)行獨立研究，這樣才能根據(jù)具體情形選擇最佳閾值;

2）Rox 添加不當(dāng)

表現(xiàn)為擴增曲線呈鋸齒狀且不連續(xù)，需校正參比染料。

9. Ct 值出現(xiàn)太晚

• 擴增效率極低：優(yōu)化反應(yīng)條件，嘗試三步法擴增程序，或者重新設(shè)計引物;

• 模板濃度太低：減少稀釋度重復(fù)實驗;

• 模板降解：重新制備模板，重復(fù)實驗;

• PCR 產(chǎn)物太長：一般將PCR產(chǎn)物長度設(shè)計為 100 bp-150 bp之內(nèi);反應(yīng)體系中存在PCR 反應(yīng)抑制劑：一般為加入模板時帶入，模板質(zhì)量不高，加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復(fù)實驗。

10. 陰性對照也出現(xiàn)明顯擴增

• 反應(yīng)體系組分（如，水）被污染：實驗過程中，更換新的 Mix 或者水重復(fù)實驗;

• 標(biāo)本間的交叉污染或產(chǎn)物污染：反應(yīng)體系在超凈工作臺內(nèi)配制，對實驗室進(jìn)行嚴(yán)格的區(qū)分，減少氣溶膠污染；使用帶濾芯的槍頭;

• 引物二聚體的出現(xiàn)：一般在 35 循環(huán)以后陰性對照出現(xiàn)擴增屬正常情況，可配合熔解曲線，PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果進(jìn)行分析。

11. 絕對定量時標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳

• 加樣誤差：加大模板稀釋倍數(shù)，提高加樣體積;

• 標(biāo)準(zhǔn)品降解：重新制備標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)實驗;

• 模板濃度太高：增加模板稀釋倍數(shù)。

12. 反應(yīng)結(jié)束無擴增曲線出現(xiàn)

• 擴增效率問題：電泳檢測 qPCR 反應(yīng)產(chǎn)物，觀察是否有目的條帶的出現(xiàn)。如果沒有，則需要逐一排查引物、模板以及反應(yīng)條件問題;

• 確認(rèn)引物是否降解：長時間未用的引物應(yīng)先通過 PAGE 電泳檢測完整性，以排除引物降解的可能性;

• 模板濃度太低或目標(biāo)基因表達(dá)豐度過低：減少稀釋度重復(fù)實驗，一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起。另外通常基因表達(dá)檢測所需的 cDNA 量為 1 到 100ng。但是如果樣本中目的基因的豐富很低，可能就需要更多的樣本量。檢測一個樣本量的范圍，或者更理想的情況下加入陽性對照反應(yīng)確認(rèn)反應(yīng)本身正常。如果對期望的表達(dá)水平不是很確定，可重新查詢文獻(xiàn)或 NCBI U

• 模板降解：重新制備模板，重復(fù)實驗;

• 逆轉(zhuǎn)錄問題：與低表達(dá)量相關(guān)，如果目的基因在樣本中的豐度很低，需要增加實驗的靈敏度。確認(rèn)一下qPCR 反應(yīng)中沒有加入過量的 cDNA (最大加樣水平為 20% v/v)，因為過量的 cDNA 樣本會引入抑制劑降低反應(yīng)效率。也可以檢查一下逆轉(zhuǎn)錄酶和引物。隨機引物通常比基于 oligo(dT) 的方法產(chǎn)生更多的 cDNA。另外，有些逆轉(zhuǎn)錄酶經(jīng)過熱穩(wěn)定性改造，也會提高 cDNA 產(chǎn)量。檢查反應(yīng)中的各組分，通過優(yōu)化各組分提高擴增效率;確認(rèn)是否是程序設(shè)置不當(dāng)：

• 如是否設(shè)置了信號采集步驟：兩部法擴增程序一般將信號采集設(shè)置在退火延伸階段；三步法擴增程序應(yīng)當(dāng)將信號采集設(shè)置在 72℃延伸階段;

• 確認(rèn)了上述因素后排查是否反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般設(shè)置循環(huán)數(shù)為 40，但需要注意的是過多的循環(huán)會增加過多的背景信號，降低數(shù)據(jù)可信度;

• 實驗設(shè)計問題如果沒有見到任何擴增，還可能是引物/探針的設(shè)計并未針對正確的靶點。檢查序列數(shù)據(jù)庫如 NCBI 搜尋目的基因的不同變異型。有可能實驗設(shè)計只是針對了其中一種變異體，但是在所研究的樣本里并無表達(dá)。同時還要檢查引物/探針靶向的目的基因的區(qū)域，是在編碼區(qū)還是內(nèi)含子？靶向 5’UTR 區(qū)域是不會檢查到轉(zhuǎn)染到細(xì)胞里的外源基因表達(dá)的 (因為 5’UTR 區(qū)域是不會包含在表達(dá)載體質(zhì)粒上的)。類似的情況，如果實驗設(shè)計是靶向內(nèi)含子序列的，也是不會從 cDNA 樣本中得到擴增的;

• 產(chǎn)品儲存是否得到：該產(chǎn)品-20℃保存可以長期保持活性，推薦-20℃保存。4℃保存將會導(dǎo)致產(chǎn)品活性下降。因反復(fù)凍融也可能導(dǎo)致產(chǎn)品活性下降，因此當(dāng)每次用量較小時，推薦小體積分裝后-20℃保存。

13. 實驗重復(fù)性差

• 加樣體積失準(zhǔn)：使用性能較好的移液槍，擴大反應(yīng)體積，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應(yīng)體系中；定量 PCR 儀不同位置溫度控制不一致：定期校準(zhǔn)儀器;

• 模板濃度太低：模板濃度越稀，重復(fù)性越差，減少模板稀釋度或提高加樣體積;qPCR mix 沒有完全混勻。請使用前充分混勻, 重復(fù)性好的擴增曲線：重復(fù)性較理想的擴增曲線 STD＜0.2。

14. 絕對定量中通過以下參數(shù)對 qPCR 結(jié)果加以判定---線性關(guān)系、擴增效率確認(rèn)

• 相關(guān)系數(shù)（R2）：＞0.98，越接近 1，結(jié)果可信度越高。R＞0.99 或 R2＞0.98；

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率：-3— -3.5，100%擴增效率對應(yīng)的斜率是-3.32；

• PCR 擴增效率（E）：90%-110%，越接近 1，越理想。其對應(yīng)的斜率為 -3.58 至-3.10。效率= 10(-1/斜率)-1；

• 檢測靈敏度確認(rèn)：35Cycles 內(nèi)可得到好的定量結(jié)果，如果采用 SYBR 檢測方法，30cycles 內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴增；

• NO template control （NTC）確認(rèn)：35cycles 內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生；重復(fù)性:STD＜0.2。

15. 絕對定量和相對定量的差別？

• 絕對定量目的是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說的拷貝數(shù):相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數(shù);絕對定量實驗必須使用已知拷貝數(shù)的絕對標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線:

• 相對定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線;相對定量實驗有兩種方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和 Ct 值比較法。如果使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，可以使用絕對標(biāo)準(zhǔn)品，也可以使用相對標(biāo)準(zhǔn)品，而且相對標(biāo)準(zhǔn)品在實驗操作上更為簡便易行。相對標(biāo)準(zhǔn)品是只知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)品，典型的做法是將一個已知 pg 數(shù)的樣品做一系列梯度稀釋。