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HPLC中的干擾峰是廣大色譜工作者甚為頭疼的事情，我們通過(guò)對(duì)干擾峰的來(lái)源進(jìn)行分類，對(duì)其產(chǎn)生原因進(jìn)行分析探究，以便大家進(jìn)行參考快速解決同類問(wèn)題。
關(guān)于其干擾峰，我們簡(jiǎn)單分為三類：試劑或溶劑、器材以及液相系統(tǒng)。下面我們會(huì)對(duì)每一類干擾峰來(lái)源做簡(jiǎn)單的分析。
試劑或溶劑
HPLC中，常用的試劑主要是有機(jī)溶劑、各種鹽類及水。有機(jī)溶劑一般多為購(gòu)買的色譜級(jí)，所以出現(xiàn)問(wèn)題的幾率較小。但是分裝出的有機(jī)溶劑，由于多次使用，被污染的概率較大，因此引入干擾峰的幾率較高。其次是水，水中的雜質(zhì)是干擾峰的主要來(lái)源之一，這是大家極易忽視的問(wèn)題。
采集波長(zhǎng)較低的檢測(cè)方法，建議使用高品質(zhì)水，這樣可以避免很多因?yàn)樗|(zhì)帶來(lái)的問(wèn)題。再次是各種鹽類，這也是色譜干擾峰的主要來(lái)源之一。對(duì)于無(wú)機(jī)鹽引入的干擾峰，在方法開發(fā)初期一般就會(huì)給眼關(guān)注，尋找解決方案。方法確定后，鹽的品種及級(jí)別也同時(shí)確定，因此鹽對(duì)方法的影響基本可控。
水和無(wú)機(jī)鹽引起的干擾峰，比較快捷的解決方案是安裝鬼峰補(bǔ)集柱，這樣可以有效的避免此類干擾。如果使用離子對(duì)試劑，則需選擇不影響離子對(duì)試劑的鬼峰補(bǔ)集柱。
研創(chuàng)鬼峰柱
器材
干擾峰來(lái)源的第二個(gè)方面是流動(dòng)相配制及樣品前處理過(guò)程中接觸的各種器材。
首先是流動(dòng)相配制過(guò)程中接觸的器材，包括燒杯、玻璃棒、pH計(jì)、濾杯、濾膜、流動(dòng)相瓶等。燒杯、玻璃棒是配制流動(dòng)相首先接觸的器材，因此建議配制流動(dòng)相的燒杯、玻璃棒專用。濾杯實(shí)驗(yàn)人員只要清洗干凈一般不會(huì)帶來(lái)污染。需要注意的是，如果過(guò)濾含有離子對(duì)的流動(dòng)相，建議增加清洗次數(shù)，避免清洗不干凈污染后續(xù)流動(dòng)相。因此，對(duì)濾杯的清洗應(yīng)該建立基本的洗滌規(guī)程，保證實(shí)驗(yàn)人員對(duì)使用的器材清洗到位。濾膜也是干擾峰引入源頭之一。如圖3所示，乙腈經(jīng)過(guò)有機(jī)系濾膜過(guò)濾后，在梯度洗脫中會(huì)引入較大干擾峰。鑒于色譜級(jí)試劑廠家已經(jīng)過(guò)膜，且多數(shù)儀器都有脫氣機(jī)，所以我們建議無(wú)需再對(duì)甲醇、乙腈等純有機(jī)相過(guò)濾。流動(dòng)相瓶引入干擾峰的現(xiàn)象主要出現(xiàn)在夏季，這是由于夏季溫度高，純水相容易滋生細(xì)菌。后續(xù)的流動(dòng)相瓶使用人員清洗不到位，所以導(dǎo)致引入干擾峰。因此流動(dòng)相瓶的清洗要建立嚴(yán)格的洗滌規(guī)程。
再次樣品前處理過(guò)程中接觸的器材。前處理過(guò)程中接觸的器材主要包括容量瓶、濾頭、注射器及進(jìn)樣瓶。容量瓶的清洗同流動(dòng)相瓶、過(guò)濾裝置一樣，要建立良好的清洗規(guī)程。移液器材以及濾頭、注射器，多為塑料制品，其化學(xué)惰性較玻璃制品差，因此容易引入干擾峰。如下圖4、圖5、圖6所示案例，此方法檢測(cè)波長(zhǎng)為210納米，溶劑為正己烷-異丙醇（90:10），溶劑分別接觸移液槍槍頭、一次性吸管、一次性注射器后，均引入不同的干擾峰。
進(jìn)樣小瓶若為一次性使用，一般不會(huì)引入干擾峰。如果進(jìn)樣瓶反復(fù)清洗，多次使用，則應(yīng)建立清洗規(guī)程并對(duì)其清洗干凈程度進(jìn)行確認(rèn)。
液相系統(tǒng)
與前兩類干擾峰相比，液相系統(tǒng)干擾峰的解決更加困難。液相系統(tǒng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，所以此類問(wèn)題解決過(guò)程耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，而且要求實(shí)驗(yàn)人員有很高的色譜素養(yǎng)。我們對(duì)此類問(wèn)題來(lái)源主要?dú)w結(jié)為三類：強(qiáng)保留物質(zhì)、離子對(duì)污染和管路滋生細(xì)菌。
首先是強(qiáng)保留物質(zhì)的干擾，其主要特征是寬峰。此類問(wèn)題多數(shù)發(fā)生在等度洗脫中，梯度洗脫主要出現(xiàn)在高比例有機(jī)相處。這是由于強(qiáng)保留物質(zhì)在當(dāng)次進(jìn)樣中未洗脫出，在后續(xù)進(jìn)樣洗脫出來(lái)所致。
對(duì)于此類干擾峰，可通過(guò)延長(zhǎng)采集時(shí)間或增加洗脫強(qiáng)度來(lái)消除對(duì)后續(xù)樣品的干擾。至于如何延長(zhǎng)采集時(shí)間，大家可通過(guò)下面的公式計(jì)算得到。
N＝5.54*(tR/Wb/2)^2（1）
由公式（1）推導(dǎo)可知
tR＝Wb/2 *(N/5.54)^(1/2)（2）
其中，N-塔板數(shù)，在等度洗脫中N對(duì)所有峰相同；tR-保留時(shí)間；Wb/2-色譜峰半峰寬。
由公式（2）推知，tR2=tR1* W2b/2/W1b/2。積分結(jié)果顯示，圖7中，7min處的色譜峰W1b/2=0.12min，9min處的寬峰W1b/2=0.32min，由此可推知，圖7中9min處的寬峰保留時(shí)間tR2=7*0.32/0.12=18.6min。圖8為延長(zhǎng)采集時(shí)間的圖譜，20min處即為圖7中9min處的色譜峰，與公式推導(dǎo)結(jié)果基本接近。延長(zhǎng)采集時(shí)間后，后續(xù)圖譜干擾峰消失。盡管按照此公式計(jì)算會(huì)有一定誤差，但這足以讓色譜工作者對(duì)其進(jìn)行預(yù)判，設(shè)置合理的采集時(shí)間。
系統(tǒng)干擾峰第二個(gè)方面是離子對(duì)、螯合劑這種難以洗脫的試劑對(duì)液相系統(tǒng)的污染。此類污染物多半是由于使用完畢含有離子對(duì)、螯合劑之類的流動(dòng)相后，對(duì)系統(tǒng)的沖洗不徹底所致。此類污染物主要對(duì)一些采集波長(zhǎng)較低的方法產(chǎn)生干擾，普遍表現(xiàn)是基線噪音大或者干擾峰，但隨著方法的運(yùn)行會(huì)逐漸趨于正常。
系統(tǒng)干擾峰第三個(gè)方面是系統(tǒng)滋生細(xì)菌。對(duì)于系統(tǒng)滋生細(xì)菌，多數(shù)大家可能覺(jué)得不可思議，因?yàn)橐合嘞到y(tǒng)使用完畢都會(huì)用有機(jī)相沖洗保存。目前很多方法流動(dòng)相A都是水相，雖然水相每日都會(huì)新配制，但如果由濾頭到比例閥這一段管路長(zhǎng)時(shí)間在水相中就會(huì)滋生細(xì)菌。隨著時(shí)間的運(yùn)行，梯度洗脫中會(huì)逐漸的產(chǎn)生干擾峰。此類問(wèn)題雖然比較隱蔽，但比較容易解決，只要每日對(duì)放置純水相的通道用有機(jī)相沖洗即可避免此類問(wèn)題。
以上便是對(duì)干擾峰來(lái)源的簡(jiǎn)單分析。然而對(duì)于干擾峰的產(chǎn)生，要具體問(wèn)題具體分析，因?yàn)槠溥�與具體色譜條件有關(guān)。同一種試劑，在方法A中產(chǎn)生干擾，但在方法B中可能完全沒(méi)有干擾。因?yàn)椴杉ㄩL(zhǎng)，有機(jī)相初始比例及最終比例等因素，都可能會(huì)對(duì)干擾峰的出現(xiàn)產(chǎn)生影響。
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實(shí)際工作中，色譜工作者遇到的最大困難是如何識(shí)別判斷干擾峰屬于哪一類。由于找不清問(wèn)題根源，所以也就難以有針對(duì)性的解決問(wèn)題。下面為大家簡(jiǎn)單分享一下解決干擾峰的小經(jīng)驗(yàn)：
首先，判斷干擾峰是來(lái)自系統(tǒng)還是供試品。此時(shí)需要運(yùn)行兩次采集：只運(yùn)行梯度與正常進(jìn)樣。如果只運(yùn)行梯度，未進(jìn)樣品，依然有干擾峰，這種情況下多半是系統(tǒng)所致，此時(shí)解決方向應(yīng)針對(duì)液相體系，而不是針對(duì)供試品。鑒于有些型號(hào)的儀器，如果不進(jìn)樣，不會(huì)執(zhí)行進(jìn)樣的動(dòng)作。因此，對(duì)于此類儀器，建議執(zhí)行正常進(jìn)樣與減少進(jìn)樣量?jī)纱尾杉�，根�?jù)干擾峰的大小來(lái)判斷是系統(tǒng)原因還是供試品原因。
其次，調(diào)查儀器使用記錄，與實(shí)驗(yàn)人員交流。一般建議查看儀器使用記錄，了解近期運(yùn)行哪些方法以及這些方法的流動(dòng)相組成。查看完相關(guān)記錄后，再跟實(shí)驗(yàn)人員交流，了解其操作過(guò)程。比如，對(duì)于A通道滋生細(xì)菌問(wèn)題，我們可以通過(guò)儀器使用記錄發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)干擾峰的儀器近一周都是在運(yùn)行同一個(gè)方法。實(shí)驗(yàn)記錄顯示，此方法的流動(dòng)相為0.1%的磷酸水溶液，因此可能是系統(tǒng)滋生細(xì)菌所致。但實(shí)驗(yàn)人員告知，每天晚上都會(huì)用有機(jī)相沖洗色譜柱，不可能滋生細(xì)菌。再次詢問(wèn)得知，實(shí)驗(yàn)人員每晚的沖洗是切換成C通道執(zhí)行，而A通道卻一直在0.1%的磷酸水溶液中。因此，切換通道沖洗系統(tǒng)這種不規(guī)范操應(yīng)盡量避免。
第三，采取單因素試驗(yàn)解決問(wèn)題。每次只改變一個(gè)因素，逐步找到干擾峰的來(lái)源。此類做法看似比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，但卻讓色譜工作者對(duì)各類色譜問(wèn)題產(chǎn)生原因有理性認(rèn)知，增強(qiáng)了色譜工作者解決問(wèn)題能力，有助于后期問(wèn)題的解決排查。
