手機版
- 01 -
概述
在紫外-可見分光光度法、高效液相色譜法與氣相色譜法三個領域中均有“溶劑效應”這一術語，分別具有不同的意義，由于篇幅有限，本文僅討論高效液相色譜法最常用的反相色譜中的溶劑效應，其他如正相色譜、離子色譜、親水作用色譜等可參考本文的分析方法與相關原理。
- 02 -
什么是溶劑效應
目前較為公認的對于溶劑效應的理解為稀釋劑溶劑強度大于流動相時造成色譜峰變形的現(xiàn)象。如用純乙腈溶解樣品，注入流動相為乙腈-水（18:82）的反相系統(tǒng)中，會造成峰分叉或拖尾的結果。但是這種概念不能解釋實踐中其他由稀釋劑導致的色譜行為異常現(xiàn)象，如溶出曲線研究中pH6.8溶出介質的溶出樣品主峰峰型異常、或加入SDS助溶后峰分叉等情況，這些情況中稀釋劑的溶劑強度并不一定大于流動相，但是卻發(fā)生了色譜行為異常的現(xiàn)象。
鑒于許多由稀釋劑導致的色譜行為異�，F(xiàn)象不能用目前的溶劑效應進行解釋，研究人員認為有必要將溶劑效應的概念進行重新闡述。溶劑效應，是指由于供試品中特定組分在稀釋劑與流動相中所處狀態(tài)的差異對色譜行為的不利影響。如果這種不利影響較為嚴重，則可能造成明顯的色譜行為異常，如峰分叉、拖尾等。
- 03 -
常見溶劑效應的表征
溶劑效應是一種對色譜行為的不利影響，影響程度不同，色譜行為的表征也各有不同；較輕的影響可能沒有明顯的色譜行為的異常如無法觀察到的峰輕度展寬等，次一級的可能表現(xiàn)為峰明顯展寬、低柱效，較為嚴重表現(xiàn)有特定組分峰保留時間不穩(wěn)定、峰型異常、響應值不穩(wěn)定等。
峰型異常是最直觀也是最常見的溶劑效應的表現(xiàn)形式，如峰分叉、拖尾、前沿等。保留時間不穩(wěn)定與響應值不穩(wěn)定也是較為常見的表現(xiàn)形式，可能也會伴隨峰型異常的情況；較為難以覺察到的溶劑效應是峰型正常只是響應值波動較大的情況，易誤判為儀器故障等系統(tǒng)適用性方面的原因，如方法開發(fā)期間發(fā)現(xiàn)峰對稱、但柱效較低且連續(xù)進樣RSD較大，建議評估溶劑效應的風險。
溶劑效應具有一定的規(guī)律，如保留時間小的組分峰較易發(fā)生，多組分色譜圖中出峰較晚的組分峰型較好、減少進樣量一般可減輕等，在實踐中可根據(jù)該規(guī)律對色譜行為異常是否為溶劑效應進行初步的判斷。
- 04 -
原理及解決方法
（1）洗脫能力
這是目前一般意義上的理解，即上文提到的“純乙腈溶解樣品，注入流動相為乙腈-水（18:82）的反相系統(tǒng)中，會造成峰分叉或拖尾的結果”。如果稀釋劑的洗脫能力大于流動相，則可能導致溶劑效應。
解決方法為調(diào)整稀釋劑或流動相，使二者的洗脫能力接近或稀釋劑的洗脫能力低于流動相。一般情況下，為避免洗脫能力導致的溶劑效應，反相色譜中較為穩(wěn)妥的做法是稀釋劑中有機相比例低于流動相或相當，必要時可略高于流動相，但應當評估其溶劑效應的風險，如根據(jù)上文提到的規(guī)律進行判斷等。
（2）化合物的電離狀態(tài)
藥物活性成分很多都可以離子化，如苯磺酸氨氯地平、青霉素鉀等，這類化合物絕大多數(shù)不是強電解質，只能部分電離。即電離平衡中一部分是離子狀態(tài)另一部分是分子狀態(tài)，兩種狀態(tài)在固定相與流動相的分配是不一樣的。在反相系統(tǒng)中，分子狀態(tài)與固定相結合更為緊密，保留更強；離子狀態(tài)則更傾向于流動相，保留較弱。
設想一種情況，如果樣品為堿性化合物，稀釋劑為pH6.8緩沖鹽溶液（溶出曲線研究較為常見），流動相為pH3.0的磷酸鹽溶液-有機相系統(tǒng)，這有非常大的可能導致明顯峰型異常的溶劑效應。因為樣品在pH6.8緩沖鹽溶液中的電離狀態(tài)遠低于pH3.0的磷酸鹽溶液，供試品溶液與流動相混合的過程中，需要一段時間將電離狀態(tài)從稀釋劑緩沖至流動相的狀態(tài)，如因某些原因（稀釋劑是緩沖鹽、流動相緩沖能力弱等）導致該時間較長，則待測組分峰極可能出現(xiàn)明顯的峰型異常。
這種情況出現(xiàn)的溶劑效應解決辦法一般有四種：更換稀釋劑使稀釋劑中待測物的電離狀態(tài)與流動相一致或接近，減少進樣量、在流動相中加入反離子或者增加流動相緩沖能力。
（3）離子締合
這種情況常見于由于待測物溶解性差在稀釋劑中含有十二烷基硫酸鈉的試驗中，待測組分峰可能嚴重變形，或者保留時間波動非常大。如果待測物為堿性化合物，則其原因為離子狀態(tài)的待測物的陽離子與十二烷基硫酸根陰離子形成離子締合物，該物質在反相色譜中保留相對于待測物極大增強；而在流動相中并不存在該締合物，流動相消除該締合物的影響時間如果較長，則會產(chǎn)生明顯的溶劑效應。
簡單的做法是更換稀釋劑，如稀釋劑不能更換，也可改變流動相，如在流動相中加入待測物的反離子，也形成離子締合物，減少待測物在稀釋劑與流動相中的差異。
（4）互變平衡
對于在溶液中存在互變結構的待測物，例如酮式烯醇式互變，如果在稀釋劑與流動相中互變異構狀態(tài)差異較大，也可能導致明顯的溶劑效應。
（5）總結
上述差異導致的溶劑效應，根本原因是待測物在固定相-稀釋劑的分配系數(shù)與固定相-流動相分配系數(shù)的較大差異導致的，是固定相、稀釋劑、流動相三方博弈的結果。因此在評估溶劑效應的風險時，應當結合三方的具體情況進行分析，對三方互相作用的力度進行評估。解決溶劑效應的上文未提到的方法就是改變固定相種類，如將C18柱更換為CN柱，因為稀釋劑與流動相中狀態(tài)的差異導致的分配系數(shù)的差異在CN柱中小于C18柱。
也就是說，消除或者減少溶劑效應的影響可以從稀釋劑、流動相與固定相三個方面著手，使稀釋劑與流動相性質接近、減少稀釋劑用量；或者使流動相與稀釋劑性質接近、增強流動相改變待測物狀態(tài)的能力；或者更改固定相種類減少待測組分狀態(tài)差異對色譜行為的影響等。
- 05 -
溶劑效應的特殊情況
本文所述稀釋劑為供試品溶液中除待測物外的所有組分，不能簡單理解為用來溶解供試品的溶劑。在進行溶劑效應的評估不能只評估待測物在溶解用溶劑中的狀態(tài)與流動相中狀態(tài)的差異，而應該結合溶液中其他組分進行評估。
設想如果開發(fā)檢測某個堿性化合物中三氟乙酸殘留的方法，很可能出現(xiàn)的情況是單獨三氟乙酸峰型正常，和堿性化合物混合后三氟乙酸峰出現(xiàn)明顯異常。結合上文離子締合的相關內(nèi)容，我們能輕易作為判斷。但如果只從溶解用溶劑來理解檢測方法中的稀釋劑，則找不到問題發(fā)生的原因。
因此在檢測供試品中某些雜質的含量時，特別是高濃度供試品溶液，極可能供試品參與溶劑效應的形成，原理參考上文相關內(nèi)容進行分析。
有關物質檢測過程中單獨各組分圖譜峰型正常，混合溶液中出現(xiàn)峰型異常的組分峰也可以理解為其他組分參與了溶劑效應的形成。
