一)基因組DNA分離、純化和加工
[Mbo I酶檢測]
1.準(zhǔn)備1.5ml小試管4個(gè);每管內(nèi)含有:
基因組DNA(在TE或水中) 10.0μg
10×Mbo I緩沖液 2.5μl
H2O 12.0μl
2.向每管中分別加入:0.1,0.5,1或2單位的Mbo I酶。
3.37℃保溫到5,10,20,40分鐘后,分別從每管中移出6μl,在干冰中貯存到下一步時(shí)一并使用。
4.把16個(gè)樣品在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,并與標(biāo)準(zhǔn)分子量進(jìn)行比較。
5.選擇參數(shù)為:能產(chǎn)生平均大小約20kb的時(shí)間和Mbo I的濃度。
[Mbo I酶切]
1.根據(jù)上述酶切檢測結(jié)果,選用最佳酶切條件,并把酶的量加大100倍,用以消化1mg的基因組DNA;取1個(gè)10~15ml的塑料管,加入:
含1mg基因組DNA 1.0ml
Mbo I 按所測定的量加
10×Mbo I緩沖液 250.0μl
H2O 1.2ml
按前述(5)中所測定出的時(shí)間(產(chǎn)生20kb)于37℃保溫。
2.用2.5ml 1:1酚和氯仿混合物抽提DNA.
3.把上層水相移入一新管中,加275μl 5M的NaCl。
4.加7ml乙醇,置冰水浴中沉淀10分鐘。
5.4℃,12 000g離心10分鐘。
6.倒除乙醇,重懸DNA于500μl TE緩沖液中,重懸過程在4℃中需數(shù)小時(shí)。
7.為獲得大小合適的DNA片段,將步驟6中的DNA分作6分(每分約80μl),分別放在含蔗糖梯度密度Beckman Ultra-clear SW41超離心管中,各通過蔗糖梯度密度儀。在含10~40%的蔗糖,20 mM Tris(pH7.4),10mM EDTA,1M NaCl等濃度中形成線性梯度。
8.135 000g 20℃離心16小時(shí)。
次日
9.用粗針頭在每一管的底部刺一小孔(依次收集6管中的DNA)每管按12滴(350~500μl)作為一分收集入a, b, c…數(shù)管中,然后再收集第二管、第三管等依次并入a, b, c各管中。
10. 從每分中都取10μl樣品加10μl水稀釋、4μl載樣緩沖液、用0.4%瓊脂糖凝膠電泳,然后與Hind Ⅲ酶切的λDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作比較,以確定那一分中所含片段為10~20kb大小。
11. 將含有16~20kb片段的管子并在一起,加2.5倍體積的乙醇,-20℃冷凍數(shù)小時(shí)。
第三天
12.10 000g 4℃離心10分鐘,收集DNA。
13.棄上清液,重懸于160μl TE緩沖液中。
14.對大小合適的片段(16~20kb)再按8~13重復(fù)梯度分離,但此次只用兩個(gè)管子即可;每管中各用80μl DNA。第二次蔗糖梯度分離后,將沉淀的DNA懸浮在50μl TE緩沖液中。
第四天
15.取2.5μl樣品(用溴化乙錠染色),與已知濃度和片段大小的DNA片段在瓊脂糖凝膠中電泳后,比較兩者染色強(qiáng)度,估算出DNA濃度,并確證所制備出插入片段的不同大小。
16.把樣品DNA濃度調(diào)到0.25μl/ml,-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>
二)用于基因克隆載體DNA(噬菌體DNA)的制備
1. 用BamH I酶切EMBL3 DNA,加:
EBML3 DNA(500μg) 500μl
10×BamH I緩沖液 100μl
BamH I (10U/μl) 100μl
H2O 300μl
2. 于37℃保溫2小時(shí)。
3. 每管中加1體積(500μl)SS-酚和氯仿(1:1)混合物。充分混勻,于微型離心機(jī)中離心2分鐘以分離兩相,吸取上清水相至新管。
4. 在每管中加500μl氯仿,充分混勻,離心2分鐘,分相。
5. 吸水相轉(zhuǎn)入新管。
6. 在各試管中加50μl 5M NaCl,再加1ml乙醇。冰水浴中冷卻10分鐘。
7. 在微型離心機(jī)中4℃離心5分鐘。
8. 棄去上清液,加1ml 80%乙醇洗滌沉淀物,離心棄去液體。
9. DNA沉淀物真空干燥。
10. 用500μl TE緩沖液溶解沉淀物。
11. EcoR I酶切EBML3 DNA,加:
從步驟10中所獲DNA 500μl
10×EcoR I緩沖液 100μl
EcoR I (1 000U) 100μl
H2O 300μl
12. 于37℃保溫4小時(shí)。
13. 按3-9抽提、沉淀并回收。
14. 用500μl TE緩沖液溶解沉淀物。
15. 異丙醇沉淀:在步驟14中得到的500μl DNA于1.5ml離心管中加:3M 醋酸鈉(pH6.0)75μl,異丙醇(在1.5ml微型離心管中)300μl。
16. 冰水浴中置15分鐘。
17. 在微型離心機(jī)中4℃離心10分鐘。
18. 棄上清液,用200μl 0.35M醋酸鈉和乙醇(1:2.5)溶液洗滌沉淀物。
19. 在微型離心機(jī)中4℃離心10分鐘。
20. 重復(fù)步驟18和19。
21. 棄去上清液,真空干燥沉淀物。
22. 以0.5μg/μl濃度溶解于TE緩沖液中。
23. -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
三)基因組DNA和載體噬菌體DNA的連接和包裝
1.可按下列步驟在5個(gè)1.5ml的小離心管中(用筆標(biāo)記上從A到E)加入下列試劑:10×連接酶緩沖液1.0μl,載體臂DNA(0.5μg/μl)2.0μl。
2.再往每管中加:
A
B
C
D
E
Mbo I插入片段(0.25μg/μl)
-
1μl
2μl
3μl
4μl
H2O
6μl
5μl
4μl
3μl
2μl
T4 DNA連接酶
1μl
1μl
1μl
1μl
1μl
每管總量10μl
3. 令其充分混合,離心,于14℃保溫12~16小時(shí),連接物可在-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
4. 包裝方法:為簡便起見,可購買包裝抽提物。各管子中的10μl連接液都用于包裝,按產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。包括將連接物和包裝抽提液混合,然后22℃保溫2小時(shí)。
5. 包裝混合液用TMG緩沖液稀釋至250μl,包裝后的DNA于4℃保存,切勿冷凍。
6. 取等分稀釋液,倒平板,確定建庫的最適比例;然后按最適比例一系列連接和包裝反應(yīng),再合并。構(gòu)建文庫要測效價(jià)和倒平板,以便供篩選和擴(kuò)增之用。
四) 測效價(jià)和制備文庫平板
1.取500ml消毒培養(yǎng)瓶,注入100ml消毒LB培養(yǎng)液,再接種入2ml含有新鮮LE392細(xì)菌的麥芽糖液,培養(yǎng)至OD600近1.0。
2.收集細(xì)胞分別于兩個(gè)帶螺旋帽50ml聚苯乙烯管中;2500g離心10分鐘。
3.棄上清,把每一沉淀物重懸入25ml消毒的10mM MgSO4中。
4.LE392細(xì)胞在4℃中可存兩周;貯存過長會降低接種存活率。
5.接種噬菌體和測效價(jià):從每250μl包裝反應(yīng)液中取1μl(從前(三)中5),加入到99μl TMG中,分1μl和10μl此稀釋液加入13mm(直徑)×100mm(長)消毒管中;同時(shí)也稀釋和鋪制克隆載體平板、連接和包裝,但無插入(三種A管),作為本底對照。
6.從4步驟向每管中加200μl LE392細(xì)菌,混勻,室溫孵育20分鐘。
7.加2.5ml含有10 mM MgSO4的上層瓊脂(48℃);在室溫中把每管立即倒入瓊脂平板上,旋動,令上層瓊質(zhì)分散均勻。
8.室溫中置5分鐘,令瓊脂變硬,反置平板,37℃中培養(yǎng)8~16小時(shí),當(dāng)LE392細(xì)胞長滿后,由于溶菌作用,空斑形成將非常明顯。
9.計(jì)算每一包裝反應(yīng)效價(jià),統(tǒng)計(jì)每一平板空斑數(shù),理想濃度的插入片段的效價(jià)應(yīng)是:如建立文庫成功,與無插入對照文庫相比,至少大5~10倍。
10. 放大:如需放大,應(yīng)用足夠反應(yīng)樣品去建庫,在最適條件下重復(fù)連接和包裝反應(yīng),但不擴(kuò)大反應(yīng)規(guī)模;對哺乳動物基因組,理想的目標(biāo)文庫大小是1~2×106噬菌斑,合并包裝混合物,并通過倒平板計(jì)算噬菌斑數(shù),用來測定其效價(jià),或文庫的含量。
11. 以下7個(gè)步驟是倒平板供文庫篩選,如果篩選前要擴(kuò)增文庫,則可按六、文庫擴(kuò)增法進(jìn)行,然后再回到步驟12。
12. 文庫倒平板篩選:要篩選5×105~106噬菌斑,一般每個(gè)90mm LB瓊脂平板上有104噬菌體;先取20ml LE392細(xì)胞;裝入50ml無菌帶帽塑料試管中,在細(xì)菌中加入已知效價(jià)的包裝混合液5×105~106噬菌斑,混合。
13. 室溫中置20分鐘,令噬菌體附到細(xì)胞上。
14. 在50~100個(gè)13×100mm的無菌玻璃試管中各加200μl受吸附的細(xì)菌。
15. 室溫下每管各加2.5ml 48℃融化的無菌LB上層瓊脂糖,并立即倒在LB瓊脂平板上,搖動使之分布均勻,連續(xù)倒完全部平板。
16. 室溫下置15分鐘,使上層瓊脂糖凝固,于37℃倒置培養(yǎng)8~16小時(shí)。
17. 此間將出現(xiàn)噬菌斑。
18. 4℃保存平板。
五) 用放射性探針篩選已倒平板的文庫
1. 將瓊脂平板翻轉(zhuǎn),令瓊脂面下,去掉培養(yǎng)皿蓋,在室溫中空氣干燥30分鐘。
1.給每個(gè)培養(yǎng)皿編號,用筆在對應(yīng)的NC濾膜上編號。
2.把濾膜小心地鋪在瓊脂平板上,編號朝上,濾膜0.5~1分鐘內(nèi)變濕,持續(xù)20分鐘使噬菌斑吸附到NC濾膜上。
3.用一根干凈的18號針頭穿過濾膜和瓊脂糖,戳5~10個(gè)孔,使濾膜在瓊脂糖膜上定位(此步很重要)。
4.用扁鉗小心緩慢從平板上揭下濾膜,注意不要掀起含噬菌體的瓊脂糖層,用記號筆在培養(yǎng)皿底部標(biāo)記針孔。
5.令號碼面朝下,在室溫中置30分鐘讓濾膜干燥,每個(gè)平板可再影印第2張濾膜,此對消除假陽性信號很有用,因所有的真陽性應(yīng)在兩張膜的同一位置上雜交,另外,第二張濾膜也可用第二種探針雜交。
6.將濾膜相繼浸入100ml下列3種溶液中(30~60秒/每次):
a. 0.2M NaOH,1.5M NaCl
b. 2×SSC,0.4M Tris pH7.4
c. 2×SSC
每浸潤25張濾膜后更換一次溶液
7.硝酸纖維素膜面朝上,放置在Whatman 3mm紙上,室溫種干燥1小時(shí)。
8.80℃真空干燥2小時(shí)。
9. 用雜交緩沖液濕潤所有濾膜,切口平移的探針用緩沖液-N,合成探針用緩沖液-S。
10. 在1只1L燒杯中,放入濾膜和足夠量的雜交緩沖液,浸泡濾膜。
11. 準(zhǔn)備雜交探針:將比活性為108cmp/μg的切口平移探針0.25μg加到1個(gè)帶螺紋帽的50ml試管中,加0.5ml 2mg/ml的鮭魚精子DNA溶液,再依次加入下列溶液并振蕩混合使其變形:10M NaOH 50μl; 2M Tris pH7.4 300μl; 1M HCl(延壁加)500μl。
12. 將此變性的探針加到放有濾膜和緩沖液的燒杯中,旋轉(zhuǎn)均勻。
13. 于42℃振蕩(輕輕搖動)4~16小時(shí),使切口平移探針雜交(合成探針的保溫溫度不同)。
14. 倒出燒杯中的雜交緩沖液,用500ml含0.1%SDS(W/V)2×SSC溶液在室溫中搖動15分鐘。
15. 按步驟15再洗兩次,低鹽洗滌前用吸水紙吸干所有濾膜。
16. 用含0.1%SDS(W/V)0.1×SSC 500ml,52℃洗滌濾膜兩次,每次15分鐘。
17. 倒去洗滌緩沖液,用Whatman 3mm濾紙吸干濾膜,在空氣中干燥1小時(shí)。
18. 將NC濾膜貼在3mm濾紙上,用放射性墨水標(biāo)記3mm濾值;濾膜用干凈塑料紙包好,用增強(qiáng)屏在XAR-5底片下于-70℃曝光過夜,檢測陽性信號。
第二次篩選
19. 將200μl LE392指示菌加到13×100mm試管中。加2.5ml含10mM MgSO4的48℃ LB上層瓊脂,室溫下立即倒入90mm的LB瓊脂板上,靜止5分鐘使之凝固,形成細(xì)菌苔,在培養(yǎng)皿底劃50個(gè)格子,供第二次噬菌體的生長。
20. 按照膜上放射性墨水標(biāo)記與X光底片對齊,用標(biāo)記筆將膜上的位置孔標(biāo)記在底片上,用透射光幫助對齊。
21. 根據(jù)放射自顯影信號,用牙簽挑取陽性噬菌體斑或其附近噬菌體。
22. 將牙簽上噬菌體斑,點(diǎn)在各個(gè)菌苔方格里,只要將牙簽尖在菌苔上輕輕觸一下即可。
23. 倒置平板,37℃培養(yǎng)過夜。
24. 加蓋NC濾膜,篩選,按步驟1-19進(jìn)行。
第三次篩選
25. 用牙簽轉(zhuǎn)移來自每一個(gè)原始陽性信號的第二輪單個(gè)雜交噬菌斑中的噬菌體,每個(gè)牙簽可轉(zhuǎn)移106~107個(gè)噬菌體顆粒。
26. 將牙簽放進(jìn)盛有10ml無菌TMG緩沖液的無菌管中,劇烈振蕩混合,以混勻噬菌體。
27. 將步驟27的TMG混合液0.25μl和2.5μl放入兩個(gè)含有200μl LE 392倒平板細(xì)胞的13×100mm管子內(nèi),加2.5ml 48℃含10mM MgSO4的LB上層瓊脂,室溫下立即倒在90mm的LB瓊脂板上,搖動使之分布均勻,室溫下凝固15分鐘。
28. 倒置平板,37℃培養(yǎng)過夜,每個(gè)平板應(yīng)形成50~500個(gè)噬菌斑。
29. 用干凈牙簽從100~200個(gè)單獨(dú)分開的噬菌斑中,把噬菌體轉(zhuǎn)移到長有LE392菌苔的平板上。
30. 倒置平板,37℃培養(yǎng)過夜。
31. 按步驟1-19對格子里的噬菌體作第三次雜交和篩選。陽性信號為純化的噬菌斑克隆,每一個(gè)來自初始陽性信號的“戰(zhàn)勝者”,按步驟26用牙簽轉(zhuǎn)移到5ml TMG液。
32. 加1μl TMG混合液到200μl LE392到平板細(xì)胞中,按步驟28和29進(jìn)行,37℃倒置培養(yǎng)過夜。
33. 此平板上所有的噬菌斑,都是該克隆的純化噬菌斑,這平板可用Parafilm封柱,貯于4℃中,作為克隆的原種。平板上的單個(gè)噬菌斑,可直接用于這種噬菌體生長的制備。
六)文庫擴(kuò)增
1.每2×104文庫中的噬菌體在一個(gè)無菌的13×100mm試管中同200μl LE392細(xì)胞混合。一般說,擴(kuò)增2×106個(gè)噬菌斑的文庫需100個(gè)試管,室溫下吸附培養(yǎng)20分鐘。
2.在每個(gè)試管中加入含10mM MgSO4 48℃的軟瓊脂2.5ml室溫下立即倒在90mm的LB瓊脂板上,搖動鋪勻,不要倒轉(zhuǎn)平板,否則瓊脂會滑到一邊,37℃培養(yǎng)6~10小時(shí)。
3.當(dāng)噬菌體開始形成針尖狀噬菌體斑,而尚未變大連接成片時(shí),加2ml LB培養(yǎng)液,用無菌塑料棒或彎曲的移液玻璃管從平板上刮下軟瓊脂,裝入一個(gè)無菌的1L燒杯中,每100ml體積平板上刮下的軟瓊脂中加2ml氯仿。
4.在一末端為圓錐形的無菌離心管中,3000g離心混合物10分鐘,瓊脂和細(xì)菌碎片將在管底形成沉淀,輕輕倒出含有擴(kuò)增文庫的上清液。
5.測定文庫體積:加NaCl晶體至種濃度為1M。
6.稀釋和倒平板,以測定擴(kuò)增文庫效價(jià),標(biāo)準(zhǔn)的效價(jià)為每1ml 5×109~1010個(gè)噬菌體。
7.將文庫分裝在1ml無菌管中,每管加3滴氯仿,4℃貯存。
8.在倒平板和篩選前再測定文庫效價(jià)。