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      生物芯片雜交

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

      待分析基因在與芯片結(jié)合探針雜交之前必需進(jìn)行分離、擴(kuò)增及標(biāo)記。根據(jù)樣品來源、基因含量及檢測方法和分析目的不同,采用的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記方法各異。當(dāng)然,常規(guī)的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記技術(shù)完全可以采用,但操作繁瑣且費(fèi)時(shí)。高度集成的微型樣品處理系統(tǒng)如細(xì)胞分離芯片及基因擴(kuò)增芯片等是實(shí)現(xiàn)上述目的的有效手段和發(fā)展方向。為了獲得基因的雜交信號(hào)必須對目的基因進(jìn)行標(biāo)記,目前采用的最普遍的熒光標(biāo)記方法與傳統(tǒng)方法如體外轉(zhuǎn)錄、PCR、逆轉(zhuǎn)錄等原理上并無多大差異,只是采用的熒光素種類更多,這可以滿足不同來源樣品的平行分析。用計(jì)算機(jī)控制的高分辨熒光掃描儀可獲得結(jié)合于芯片上目的基因的熒光信號(hào),通過計(jì)算機(jī)處理即可給出目的基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)信息。

      雜交條件的選擇與研究目的有關(guān),多態(tài)性分析或者基因測序時(shí),每個(gè)核苷酸或突變位點(diǎn)都必須檢測出來。通常設(shè)計(jì)出一套四種寡聚核苷酸,在靶序列上跨越每個(gè)位點(diǎn),只在中央位點(diǎn)堿基有所不同,根據(jù)每套探針在某一特點(diǎn)位點(diǎn)的雜交嚴(yán)謹(jǐn)程度,即可測定出該堿基的種類。如果芯片僅用于檢測基因表達(dá),只需設(shè)計(jì)出針對基因中的特定區(qū)域的幾套寡聚核苷酸即可。表達(dá)檢測需要長的雜交時(shí)間,更高的嚴(yán)謹(jǐn)性,更高的樣品濃度和低溫度,這有利于增加檢測的特異性和低拷貝基因檢測的靈敏度。突變檢測,要鑒別出單堿基錯(cuò)配,需要更高的雜交嚴(yán)謹(jǐn)性和更短的時(shí)間。

      此外,雜交反應(yīng)還必須考慮雜交反應(yīng)體系中鹽濃度、探針GC含量和所帶電荷、探針與芯片之間連接臂的長度及種類、檢測基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。有資料顯示探針和芯片之間適當(dāng)長度的連接臂可使雜交效率提高150倍[9]。連接臂上任何正或負(fù)電荷都將減少雜交效率。由于探針和檢測基因均帶負(fù)電荷,因此影響他們之間的雜交結(jié)合,為此有人提出用不帶電荷的肽核酸(PNA)做探針[9]。雖然PNA的制備比較復(fù)雜,但與DNA探針比較有許多特點(diǎn),如不需要鹽離子,因此可防止檢測基因二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成及自身復(fù)性。由于PNA-DNA結(jié)合更加穩(wěn)定和特異,因此更有利于單堿基錯(cuò)配基因的檢測。

       

       

       

       
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