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      核酸分子雜交技術(shù)

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

      由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的靈敏性,它已成為分子生物學(xué)中最常用的基本技術(shù),被廣泛應(yīng)用于基因克隆的篩選,酶切圖譜的制作,基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測等。其基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下(適宜的溫室度及離子強(qiáng)度等)可按堿基互補(bǔ)原成雙鏈。雜交的雙方是待測核酸序列及探針(probe),待測核酸序列可以是克隆的基因征段,也可以是未克隆化的基因組DNA和細(xì)胞總RNA。核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記的,能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNA或RNA片段。根據(jù)其來源和性質(zhì)可分為cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。

      固相雜交

      固相雜交(solid-phase hybridization)是將變性的DNA固定于固體基質(zhì)(硝酸纖維素膜或尼龍濾膜)上,再與探針進(jìn)行雜交,故也稱為膜上印跡雜交。

      斑步雜交(dot hybridization)

      是道先將被測的DNA或RNA變性后固定在濾膜上然后加入過量的標(biāo)記好的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。該法的特點是操作簡單,事先不用限制性內(nèi)切酶消化或凝膠電永分離核酸樣品,可在同一張膜上同時進(jìn)行多個樣品的檢測;根據(jù)斑點雜并的結(jié)果,可以推算出雜交陽性的拷貝數(shù)。該法的缺點是不能鑒定所測基因的相對分子質(zhì)量,而且特異性較差,有一定比例的假陽性。

      印跡雜交(blotting hybridization)

      Southern印跡雜交:凝膠電離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段,將凝膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜或其他固相支持物上,經(jīng)干烤固定,再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的已標(biāo)記的探針進(jìn)行那時交反應(yīng),用放射性自顯影或酶反應(yīng)顯色,檢測特定大小分子的含量?蛇M(jìn)行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性長度多態(tài)性分析(RELP)等。

      Northern印跡雜交:由Southerm印雜交法演變而來,其被測樣品是RNA。經(jīng)甲醛或聚乙二醛變性及電泳分離后,轉(zhuǎn)移到固相支持物上,進(jìn)行雜交反應(yīng),以鑒定基中特定mRNA分子的量與大小。該法是研究基因表達(dá)常用的方法,可推臬出癌基因的表達(dá)程度。

      差異雜交(differential hybridization)

      是將基因組文庫的重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,用兩種混合的不同cDNA探針(如:轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性癌組織的mRNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA)分別與濾膜上的DNA雜交,分析兩張濾膜上對應(yīng)位置雜交信息以分離差異表達(dá)的基因。適用于基因組不太復(fù)雜的真核生物(如酵母)表達(dá)基因的比較,假陽性率較低。但對基因組非常復(fù)雜的鹽酸核生物(如人),則因工作量太大,表達(dá)的序列所占百分比較低(僅5%左右),價值不大。

      cDNA微點隈雜交(cDNA microarray hybridization)

      是指將cDNA克隆或cDNA的PCR產(chǎn)物以高度的列陣形式排布并結(jié)合于固相支持物上(如:尼龍膜或活化的載玻片)以微點陣,然后用混合的不同DNA探針與微點陣上的DNA進(jìn)行雜交。再利用熒光、化學(xué)發(fā)光、共聚焦顯微鏡等技術(shù)掃描微點陣上的雜交信息。它比差異雜交技術(shù)的效率高、速度快、成本低,適用于大規(guī)模的分析。已成商品問世。其缺點是無法克服保守的同源序列及重序?qū)﹄s交信息的干擾。

      寡核苷酸微點隈雜交(oligonucleotide microarray hybridization)

      是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸,使它共價結(jié)合于支持物表面,與平均長度為20-50nt的混合RNA或cDNA探針進(jìn)行雜交,以提高雜交的特異性和靈敏度。應(yīng)用共聚焦顯微鏡可檢測跨越三個數(shù)量級的雜交信息。適用于低豐度mRNA的檢測,以區(qū)分基因家族不同成員的差異表達(dá)特征,或鑒定同一轉(zhuǎn)錄在不同組織和細(xì)胞中的選擇性剪接。但有工作量較大、成本較高、速度較慢等弱點。

      液相雜交(solution hbridization)

      指使變性的待測核酸單鏈與放射笥核素標(biāo)記的已知的酸單鏈(探針)在溶液中保溫,使之形成雜交復(fù)合物。反應(yīng)結(jié)束后,用羥磷灰石法或酶解法將未被雜交的單鏈和雜交雙鏈分開,然后結(jié)膈后在雜妝分子中的探針量,就可推算出被測的核酸量。

      遞減雜交(subtractive hybridizatio)

      是利用兩種來源一致而功能不同的組織細(xì)胞提取mRNA(或逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA),在一定的條件下以過量的驅(qū)動mRNA或cDNA與測試的單鏈cDNA或mRNA進(jìn)行液相雜交,通過羥基磷灰石柱層析篩選除去兩者間同源的雜交體。經(jīng)多輪雜交策選、除去兩者之間相同的基因成分,保留特異表達(dá)的目的基因或工基因片段。以后者篩選cDNA文庫,可獲得特異表達(dá)的目的基因cDNA全長序列。

      核酸原位雜交

      用特定標(biāo)記的已知順序核酸作為探針與細(xì)胞級或組織切片中核酸進(jìn)行復(fù)性雜交并對其實行檢測的方法,稱為核酸原位雜交(nucleic acid hybridization in situ)。用來檢測DNA在細(xì)胞核或染色休上的分布,與細(xì)胞內(nèi)RNA進(jìn)行雜交以研究該組織細(xì)胞中特定基因表達(dá)水閏;還用于細(xì)胞、組織中有無特異性菌、病毒檢測的研究。

      該法的優(yōu)點是特異性高,可精確定位;能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響;不需要從組織中提取核酸,對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性;并可完整地保持組織與細(xì)胞的形態(tài)。因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)的研究,如基因定位、基因制失,基因易位、特異基因整合部物色檢測等研究。近年來由定性發(fā)展到定量,方法更為完善。

       

       

       
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