重組DNA技術的建立與分子雜交相結(jié)合,從分子水平研究基因定位,發(fā)展了一系列有效方法。例如原位雜交(in situ hybridization)就是分子雜交技術在基因定位中的應用,也是一種直接進行基因定位的方法。分子雜交的基本原理是堿基的互補配對,同源的DNA-DNA雙鏈或DNA-RNA鏈在一定條件下能結(jié)合成雙鏈,用放射性或非放射性物質(zhì)標記的DNA或RNA分子作為探針,可探測到細胞基因組中的同源部分。原位雜交的特點是雜交在顯微鏡載玻片上中期染色體標本上進行。所謂原位即指標本上DNA原位變性,在利用放射性或非放射性標記的已知核酸探針雜交后,通過放射自顯影或非放射性檢測體系來檢測染色體上特異DNA或RNA順序,可用放射性顆粒在某條染色體的區(qū)帶出現(xiàn)的最高頻率或熒光的強弱來確定探針的位置,從而進行準確的基因定位。
放射性同位素標記核酸探針與染色體顯帶結(jié)合進行原位雜交仍有不少缺點和局限性。例如需要使用放射性同位素的特殊實驗室,自顯影曝光時間長,同位素標記的探針不易保存,放射污染不利健康,特別是高質(zhì)量的中期染色體標本在細胞培養(yǎng)基礎上難以得到,觀察費時,對間期核的研究難以進行等。熒光原位雜交(florescence in-situ hybridization,FISH)是一種非放射性原位雜交方法。用特殊熒光素標記核酸(DNA)探針,可在染色體、細胞和組織切片標本上進行DNA雜交,對檢測細胞內(nèi)DNA或RNA的特定序列存在與否最為有效。探針不是放射性的而是將熒光染料與抗體蛋白結(jié)合進行檢測。它們具有高度親和力,有與放射性探針相同或更高的分辯率,F(xiàn)已可用不同的熒光染料同時進行多重原位雜交,顯示出不同的熒光色澤。這種多色FISH技術近年來發(fā)展迅速,已成為基因定位作圖和醫(yī)學診斷的重要手段。