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      親和層析

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

      (一)原理

      親和層析是一種吸附層析,抗原(或抗體)和相應的抗體(或抗原)發(fā)生特異性結合,而這種結合在一定的條件下又是可逆的。所以將抗原(或抗體)固相化后,就可以使存在液相中的相應抗體(或抗原)選擇性地結合在固相載體上,借以與液相中的其他蛋白質分開,達到分離提純的目的。

      此法具有高效、快速、簡便等優(yōu)點。

      (二)載體的基本要求和選擇

      理想的載體應具有下列基本條件:①不溶于水,但高度親水;②惰性物質,非特異性吸附少;③具有相當量的化學基團可供活化;④理化性質穩(wěn)定;⑤機械性能好,具有一定的顆粒形式以保持一定的流速;⑥通透性好,最好為多孔的網(wǎng)狀結構,使大分子能自由通過;⑦能抵抗微生物和醇的作用。

      可以做為固相載體的有皂土、玻璃微球、石英微球、羥磷酸鈣、氧化鋁、聚丙烯酰胺凝膠、淀粉凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素和瓊脂糖。在這些載體中,皂土、玻璃微球等吸附能力弱,且不能防止非特異性吸附。纖維素的非特異性吸附強。聚丙稀酰胺凝膠是目前的首選優(yōu)良載體。

      瓊脂糖凝膠的優(yōu)點是親水性強,理化性質穩(wěn)定,不受細菌和酶的作用,具有疏松的網(wǎng)狀結構,在緩沖液離子濃度大于0.05Mol/L時,對蛋白質幾乎沒有非特異性吸附。瓊脂糖凝膠極易被溴化氫活化,活化后性質穩(wěn)定,能經(jīng)受層析的各種條件,如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl處理2h~3h及蛋白質變性劑7Mol/L尿素或6Mol/L鹽酸胍處理,不引起性質改變,故易于再生和反復使用。

      瓊脂糖凝膠微球的商品名為Sepharose,含糖濃度為2%、4%、6%時分別稱為2B、4B、6B。因為Sepharose 4B的結構比6B疏松,而吸附容量比2B大,所以4B應用最廣。

      (三)試劑與配制

      1.Sepharose 4B

      2.CNBr(劇毒)

      3.抗原或抗體

      4.1Mol/L NaHCO3 取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。

      5.0.1Mol/L NaHCO3

      6.2Mol/L NaOH

      7.0.01Mol/L pH7.4 PBS

      0.2Mol/L Na2HPO4 38.0ml

      0.2Mol/L Na2HPO4 162.0ml

      NaCl 32.76g

      加水至4 000ml。

      8.0.1Mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸—HCl緩沖液 甘氨酸15.01g加水至1 000ml,取此液,加0.2Mol/L HCl 84ml加水166ml共500ml。

      9.7Mol/L尿素

      10.0.2Mol/L NaHCO3,(含0.1Mol/L NaCI)

      1Mol/L NaHCO3 100.00ml

      NaCl 2.93g

      加水至500.00ml。

      (四)實驗方法

      1.瓊脂糖活化

      ⑴ 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干,加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗滌,立即轉入100ml燒杯中,冰浴置于磁力攪拌器上。

      ⑵ 在通風櫥內稱取2g溴化氰,加水20ml溶解,然后倒入瓊脂糖中,小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右,反應10min。在1min~2min迅速調整pH為8.0~11.0維持10min。

      ⑶ 將活化的瓊脂糖迅速倒入布氏漏斗中,以冰水抽洗成中性,再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。

      2.偶聯(lián)蛋白 20ml 4B液體相當于一半的固相載體。

      ⑴ 事先將需偶聯(lián)的抗原(或抗體)蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析數(shù)小時(一般偶聯(lián)量為10~30mg/g載體)。

      ⑵ 將活化的瓊脂糖迅速倒入蛋白液中(在1.5min內,從抽洗到偶聯(lián)),4℃緩慢攪拌過夜,使蛋白與活化的瓊脂結合。

      3.裝柱

      ⑴ 選柱:不宜過大,一般以1.5×15cm的層析柱可裝偶聯(lián)蛋白的瓊脂糖約30ml。

      ⑵ 裝柱:將已與蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖裝入層析柱內,擰緊下口夾,讓其下沉,數(shù)分鐘后松開下口夾,使溶液約以1ml/min的速度流出。

      ⑶ 洗柱:以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3(含0.1Mol/L NaCl)洗滌至洗出液的OD280<0.02為止。

      收集全部的洗脫液,測得的OD280值×洗脫液的總ml數(shù)即為未偶聯(lián)蛋白的含量,由此可計算偶聯(lián)率。

      4.吸附與解吸附

      ⑴按床體積1/10加樣,濃度為1%~2%,緩慢加入待純化的抗體(或抗原),用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脫,流速為1ml/min,至洗出液OD280<0.02為止。

      ⑵加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸-HCl緩沖液,流速1ml/min,收集解吸附下來的成分,立即以1Mol/L NaHCO3中和,以免蛋白變性。

      5.以兩倍體積的7Mol/L尿素洗滌,再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理鹽水洗滌,平衡后,可繼續(xù)使用。保存可加入0.02%Na N3于4℃保存。防止冷凍和干裂。

      6.結果判定

      ⑴ 對解吸附下來的蛋白以圓盤電泳或雙相瓊脂糖電泳進行純度鑒定。

      ⑵ 將純度好的各管洗脫液合并,以生理鹽水透析,然后濃縮或凍干保存。

       

       

       
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