此法抽提的酵母蛋白適用于SDS凝膠電泳和Western印跡分析。
1.從OD600=2的細(xì)胞培養(yǎng)物中抽提酵母蛋白質(zhì)。培養(yǎng)物的一種簡(jiǎn)單制備方法是將細(xì)胞接種到5ml YPD中,過(guò)夜培養(yǎng)后獲得指數(shù)培養(yǎng)物(OD600=0.5~2.0)。
2.在水浴上把OD600=2的細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到含有2ml的50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、10mmol/L疊氮化鈉溶液的13mm離心管中,用吊籃式醫(yī)用離心機(jī)離心沉淀細(xì)胞。
3.用25號(hào)針頭吸出上清液,再用30μl ESB緩沖液懸浮細(xì)胞。
4.快速轉(zhuǎn)入微型離心管,在100℃下保溫3分鐘,使蛋白酶失活之后,樣品存放于-20℃。
5.加入0.1g的0.2mm的玻珠,或裝入玻珠直至液體剛好浸沒(méi),劇烈振蕩混合2分鐘。
6.加入70μl ESB緩沖液,稍加振蕩,置100℃保溫1分鐘。
ESB緩沖液(可在4℃貯存數(shù)天):
2% SDS
80 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8)
10% 甘油
1.5% 二硫基蘇糖醇(DTT)
0.1mg/ml 溴酚藍(lán)
7.取5~20μl抽提液上樣進(jìn)行SDS凝膠電泳。