1、使用地高辛標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行石蠟切片的RNA原位雜交第一天
1) 二甲苯于37℃脫蠟2次,每次15分鐘;
2) 無(wú)水乙醇浸泡2次,每次3分鐘;
3) 95%乙醇浸泡2次,每次3分鐘;
4) PBS清洗3分鐘;
5) 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘;
6) PBS清洗10分鐘;
7) 加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育15分鐘;
8) PBS清洗2次,每次3分鐘;
9) 0.2N的HCl孵育30分鐘;
10)PBS清洗2次,每次3分鐘;
11)0.25%無(wú)水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘;
12)PBS清洗2次,每次5分鐘;
13)預(yù)雜交緩沖液孵育30分鐘;
14)準(zhǔn)備核酸探針混合物:使用預(yù)雜交緩沖液稀釋探針,85℃加熱5分鐘,置于冰塊中10分鐘;
15)雜交;第二天
16)將玻片置于SSC中2次,每次5分鐘以去除封片;
17)PBS清洗3分鐘;
18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中),37℃孵育30分鐘;
19)PBS清洗5分鐘;
20)室溫,2×SSC清洗10分鐘;
21)37℃,1×SSC清洗10分鐘;
22)37℃,0.5×SSC清洗10分鐘;
23)緩沖液A孵育10分鐘;
24)緩沖液A(1%正常綿羊血清和0.03%三重氫核X-100)孵育30分鐘;
25)加入抗地高辛抗體(1/200的上述緩沖液,來(lái)自Boehringer Mannheim),37℃孵育3 小時(shí);
26)緩沖液A清洗2次,每次10分鐘;
27)緩沖液B清洗2次,每次5分鐘;
28)制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘,顯微鏡下進(jìn)行觀察,如果背景尚佳,顯色時(shí)間可延長(zhǎng)到16小時(shí);
29)停止緩沖液B的反應(yīng),用水進(jìn)行簡(jiǎn)單的清洗;
30)固紅,脫水以及封片進(jìn)行核的復(fù)染。
2、使用地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行石蠟切片的原位DNA雜交第一天
1) 二甲苯于37℃脫蠟2次,每次15分鐘;
2) 無(wú)水乙醇浸泡2次,每次5分鐘;
3) 95%乙醇浸泡2次,每次5分鐘;
4) PBS清洗5分鐘;
5) 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘;
6) PBS清洗5分鐘;
7) 加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育10分鐘;
8) PBS清洗2次,每次5分鐘;
9) 0.2N的HCl孵育30分鐘;
10)PBS清洗2次,每次5分鐘;
11)0.25%無(wú)水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘;
12)PBS清洗5分鐘;
13)預(yù)雜交緩沖液孵育30分鐘;
14)準(zhǔn)備寡核苷酸探針混合物:使用預(yù)雜交緩沖液稀釋探針;
15)雜交;第二天
16)將玻片置于SSC中以去除封片;
17)室溫,2×SSC清洗10分鐘;
18)37℃,1×SSC清洗10分鐘;
19)37℃,0.5×SSC清洗10分鐘;
20)緩沖液A孵育10分鐘;
21)緩沖液A孵育30分鐘;
22)加入抗地高辛抗體37℃孵育3小時(shí);
23)緩沖液A清洗2次,每次5分鐘;
24)緩沖液B清洗2次,每次5分鐘;
25)制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘,顯微鏡下進(jìn)行觀察,如果背景尚佳,顯色時(shí)間可長(zhǎng)到16小時(shí);
26)停止緩沖液B的反應(yīng),用水進(jìn)行簡(jiǎn)單的清洗;
27)固紅,脫水以及封片進(jìn)行核的復(fù)染。
1) 二甲苯于37℃脫蠟2次,每次15分鐘;
2) 無(wú)水乙醇浸泡2次,每次3分鐘;
3) 95%乙醇浸泡2次,每次3分鐘;
4) PBS清洗3分鐘;
5) 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘;
6) PBS清洗10分鐘;
7) 加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育15分鐘;
8) PBS清洗2次,每次3分鐘;
9) 0.2N的HCl孵育30分鐘;
10)PBS清洗2次,每次3分鐘;
11)0.25%無(wú)水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘;
12)PBS清洗2次,每次5分鐘;
13)預(yù)雜交緩沖液孵育30分鐘;
14)準(zhǔn)備核酸探針混合物:使用預(yù)雜交緩沖液稀釋探針,85℃加熱5分鐘,置于冰塊中10分鐘;
15)雜交;第二天
16)將玻片置于SSC中2次,每次5分鐘以去除封片;
17)PBS清洗3分鐘;
18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中),37℃孵育30分鐘;
19)PBS清洗5分鐘;
20)室溫,2×SSC清洗10分鐘;
21)37℃,1×SSC清洗10分鐘;
22)37℃,0.5×SSC清洗10分鐘;
23)緩沖液A孵育10分鐘;
24)緩沖液A(1%正常綿羊血清和0.03%三重氫核X-100)孵育30分鐘;
25)加入抗地高辛抗體(1/200的上述緩沖液,來(lái)自Boehringer Mannheim),37℃孵育3 小時(shí);
26)緩沖液A清洗2次,每次10分鐘;
27)緩沖液B清洗2次,每次5分鐘;
28)制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘,顯微鏡下進(jìn)行觀察,如果背景尚佳,顯色時(shí)間可延長(zhǎng)到16小時(shí);
29)停止緩沖液B的反應(yīng),用水進(jìn)行簡(jiǎn)單的清洗;
30)固紅,脫水以及封片進(jìn)行核的復(fù)染。
2、使用地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行石蠟切片的原位DNA雜交第一天
1) 二甲苯于37℃脫蠟2次,每次15分鐘;
2) 無(wú)水乙醇浸泡2次,每次5分鐘;
3) 95%乙醇浸泡2次,每次5分鐘;
4) PBS清洗5分鐘;
5) 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘;
6) PBS清洗5分鐘;
7) 加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育10分鐘;
8) PBS清洗2次,每次5分鐘;
9) 0.2N的HCl孵育30分鐘;
10)PBS清洗2次,每次5分鐘;
11)0.25%無(wú)水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘;
12)PBS清洗5分鐘;
13)預(yù)雜交緩沖液孵育30分鐘;
14)準(zhǔn)備寡核苷酸探針混合物:使用預(yù)雜交緩沖液稀釋探針;
15)雜交;第二天
16)將玻片置于SSC中以去除封片;
17)室溫,2×SSC清洗10分鐘;
18)37℃,1×SSC清洗10分鐘;
19)37℃,0.5×SSC清洗10分鐘;
20)緩沖液A孵育10分鐘;
21)緩沖液A孵育30分鐘;
22)加入抗地高辛抗體37℃孵育3小時(shí);
23)緩沖液A清洗2次,每次5分鐘;
24)緩沖液B清洗2次,每次5分鐘;
25)制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘,顯微鏡下進(jìn)行觀察,如果背景尚佳,顯色時(shí)間可長(zhǎng)到16小時(shí);
26)停止緩沖液B的反應(yīng),用水進(jìn)行簡(jiǎn)單的清洗;
27)固紅,脫水以及封片進(jìn)行核的復(fù)染。