国产精品二区按摩片,亚州另类欧美综合一区,亚洲日韩国产一区二区,国产在线观看片免费人成视频

<dfn id="yldih"></dfn>
  • <ul id="yldih"><td id="yldih"></td></ul>

  • <dfn id="yldih"></dfn>
    1. <dfn id="yldih"></dfn>
      <ul id="yldih"></ul>
      VIP標識 上網(wǎng)做生意,首選VIP會員| 設(shè)為首頁| 加入桌面| | 手機版| RSS訂閱
      食品伙伴網(wǎng)服務(wù)號
       

      原位雜交實驗步驟

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

      1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和擴增

      1.1制備XL1-Blue感受態(tài)細菌

      1. 取400uL XL1-Blue菌種加入到含200ml LB培養(yǎng)基的錐形瓶中,37 ℃、100rpm培養(yǎng)4h,離心,倒置,以冰冷的0.1 mol/L CaCl_2重懸細菌,冰浴30 min,離心,棄上清,倒置,再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重懸細菌,分裝(200 μ/tube),-80 ℃保存。
      2. 轉(zhuǎn)化:在冰浴中將1管XL1-Blue感受態(tài)菌解凍,將濃度為2ng/μ1的質(zhì)粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受態(tài)菌中。
      3. 輕輕搖勻,冰浴30 min。
      4.42 ℃熱激9O秒,然后迅速冰浴2 min。
      5. 加入LB培養(yǎng)液(無氨芐青霉素)0.8ml,在37 ℃,100轉(zhuǎn)/min水浴孵育60 min。
      6.取200μl菌液鋪于瓊脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的 LB-氨芐青霉素50 mg/ml,1μl/ml培養(yǎng)基),待菌液全部被吸收后,倒置平板于37 ℃培養(yǎng)12-16h。

      1.2鑒定和挑選含重組質(zhì)粒的菌落

      1. 用無菌牙簽挑取單菌落,接種到10 ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液的離心管中,于37 ℃,200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)2h,取1 ml之一Eppendorf離心管,加50μl10mmol/L EDTA(pH 8.0)。
      2. 加入50μl新配置的0.2mol/L NaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后,振蕩3O秒。
      3. 在70 ℃溫育5 min,然后冷卻到室溫。
      4. 加1.5μ14mol/L KCl和0.5μ1含0.4%溴酚蘭染液,振蕩3O秒后,冰浴5min。
      5. 12000g,4 ℃離以 3 min,以除去細菌碎片。
      6. 制備1%的瓊脂糖凝膠(含EB0.5μg/ml),取50μl上清液加入到樣品孔中,其中一孔加入中等分子量DNA Marker。恒壓50V,進行電泳。
      7. 當溴酚蘭遷移到凝膠全長的2/3-3/4時,停止電泳,在紫外燈下檢查質(zhì)粒DNA分于量的大小是否與轉(zhuǎn)入質(zhì)粒相符。

      1.3質(zhì)粒的擴增和純化

      1. 用無菌牙簽分別挑取單個白色菌落移入含30ml LB-氨芐青霉素(50μg/ml)培養(yǎng)液的聚丙烯管中,于37 ℃,200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)3h。
      2. 將菌液轉(zhuǎn)入含70 ml LB-氨芐青霉素培養(yǎng)液的250ml錐形瓶中,37 ℃,200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)過夜(12-16h),細菌渾濁。
      3. 菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇,100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液,終濃度為170 μ/ml)。37 ℃,200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)12-16h。
      4. 將培養(yǎng)的細菌倒入50ml的離心管中,6000rpm,4 ℃離,th,15 min,沉淀細菌。
      5. 棄凈上清夜,用2ml預(yù)冷的溶液I,懸浮菌體沉淀,劇烈振蕩,于室溫靜置5 min
      6. 加入新配制的溶液II 4ml,快速用手晃動10秒,顛倒數(shù)次后,于室溫靜置10 min。
      7. 加入預(yù)冷的溶液III 3ml,溫和振蕩l0秒,于冰上靜置10 min,出現(xiàn)白色絮狀沉淀。
      8. 6000rpm,4 ℃離心15 min,保留上清。
      9. 將上清(若帶細菌殘片,則再次離心)移入另一50ml的離心管中,加入O.6倍體積的異丙醇混勻,于室溫靜置10 min。(或-20 ℃4h,或4 ℃過夜,可便核酸沉淀)
      10.12000 rpm,4 ℃離心15 min,回收核酸。小心棄去上清,倒置離心管使殘兼上清液流盡。
      11.于室溫用70%的乙醇洗滌沉淀物和管壁,室溫12000 rpm離心,15 min,充分棄去乙醇,于室溫將離心管倒置在紙巾上,使最后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。
      12.用500μl TE(pH8.0)溶解核酸沉淀,轉(zhuǎn)移至1.5 ml Eppendorf管中。
      13.加入用冰預(yù)冷的5mol/L的LiCl溶液600μl,充分混勻。12000 rpm,4 ℃離心15 min,以沉淀高分子量的RNA。
      14.將上清轉(zhuǎn)移到另一1.5 ml Eppendorf管中,加等量異丙醇,充分混勻,于室溫靜置10min。
      15.12000 rpm,4 ℃離心15 min,回收核酸。小心棄去上清,倒置離心管使殘余上清液流盡。
      16.于室溫用70%的乙醇洗滌沉淀物和管壁,室溫12000 rpm離心,15 min,充分棄去乙醇,于室溫將離心管倒置在紙巾上,使最后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。
      17.400μl含無DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀,將溶液轉(zhuǎn)移到另-1.5 ml Eppendorf管中,室溫放置1.5ml Eppendorf管中30min。
      18.加入400μl 13%(v/v)的PEG 8000-NaCl(1.6 mol/L),混勻,4 ℃ 12000rpm離心5 min以回收質(zhì)粒DNA,棄去上清。
      19.加入400μl TE緩沖液(pH 8.O)溶解沉淀,再分別用等體積的Tris飽和酚、酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)、和氯仿各抽提一次。
      20.將水相(上清)移入另一1.5ml Eppendorf管中,加入O.1體積(約50μ13M的醋酸鈉(pH 5.2)和2倍體積(大約1 ml)的無水乙醇,充分混勻后于4℃放置30 min。
      21.于4 ℃ 12000 rpm離心5 min回收沉淀的質(zhì)粒DNA。盡可能棄去上清,敞開管口,置工作臺上使殘留的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
      22.加入400 μl處于4 ℃的70%乙醇,稍加振蕩,漂洗沉淀,4 ℃ 12000 rpm離心2 min。
      23.吸去上清,室溫敞開管口,直到乙醇完全揮發(fā)。
      24.用100μl TE緩沖液(pH 8.0)溶解沉淀。
      25.取4μl溶液1:100稀釋后,測定其OD260、OD280,以確定質(zhì)粒DNA的純度和濃度(OD260/D280>1.8。OD260/OD280對DNA而言其值大約為1.8,高于2.0則可能有RNA污染,低于1.8則有蛋白質(zhì)污染。;DNA濃度=OD260 X 0.05 X稀釋倍數(shù)(μg/μl)。
      26.質(zhì)粒DNA溶液于-20 ℃保存待用。

      二、cRNA探針的標記

      1. 將質(zhì)粒DNA,用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶線性化,通過瓊脂糖凝膠電泳以確保完全線性化。
      2. 線性化后的DNA按“質(zhì)粒的純化”步驟19-24進行純化,作為cRNA探針標記的模板,用相應(yīng)的RNA聚合酶合成地高辛標記的反義和正義RNA探針。
      3. 進行體外轉(zhuǎn)錄,步驟如下:
      4. 在冰上將各試劑加入一1.5 ml無RNA酶的Eppendorf管中。
      DEPC處理的三蒸水8μl
      質(zhì)粒DNA模板 0.05μg/μl 1μl
      10 x NTP地高辛標記混合物 1 x 2μl
      0.1 M DTT溶液 10 mM 2μl
      5 x轉(zhuǎn)錄緩沖液 1 x 4μl
      RNAse抑制劑 2U/μl 1μl
      RNA聚合酶 2U/μl 2μl
      反應(yīng)體系總體積 20μl

      5. 加入上述各試劑后,混勻,簡短離心后在37 ℃孵育2h。
      6. 加入2μl無RNA酶的DNA酶I(10U/μ1),37 ℃孵育15 min降解模板DNA。
      7. 加入0.2M EDTA(pH 8.0)溶液2μl終止反應(yīng)。
      8. 加入2.5μl的4 M Licl和7.5μl冷的無水乙醇,混勻,-20 ℃放置2h。
      9. 12000g下離以 15 min,棄上清,小心地用50 μl冷的70%乙醇洗滌沉淀。
      1O.室溫下稍干燥,溶于100μ1 DEPC處理過的三蒸水中,混勻分裝,-20 ℃下保持備用。

      三、原位雜交

      3.1冰凍切片與雜交前預(yù)處理

      1. 將子宮樣品從-80 ℃取出,用OCT包埋,在-23 ℃(切片機腔體溫度)平衡至少30 min。將包埋好的樣品固定在樣品頭上,切10μm厚的連續(xù)組織切片,平鋪于涂有多聚賴氨酸(1mg/m1)的玻片上(玻片預(yù)先經(jīng)180 ℃干烤6小時),保存于-70 ℃冰柜備用。

      2. 冰凍切片經(jīng)室溫干燥10 min后,在4%的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lOmin。
      3. 活躍的DEPC-PBS(未高壓的0.1%DEPC-1XPBS溶液)洗2次,每次5 min。
      4. 在0.2M的鹽酸作用中作用10 min后,重復(fù)步驟4)。
      5. 在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg/m1),37 ℃孵育15 min,重復(fù)步驟4)。
      6. 經(jīng)0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后,再在新配制的0.25%AA/0.1M TEA (乙酸酐/三乙醇胺,pH 8.0)中乙;10 min。
      (在大多數(shù)實驗中,步驟4,5,6省略)
      7. 5 x SSC中平衡15 min。

      3.2雜交

      8. 在脫水后的玻片上滴加預(yù)雜交液(約100 μl/玻片),置于放有濕盒液(50%甲酰胺v/v;0.3 M NaCl;1Mm EDTA;10 mM Tris-Cl,pH 8.O)的濕盒中,55~58 ℃下的烘箱中預(yù)雜交2 h。

      9. 甩掉預(yù)雜交液,地高辛標記的反義或正義cRNA探針(濃度1-2ng/μl)經(jīng)70 ℃變性1O分鐘,置冰上1 min,玻片上滴加預(yù)雜交液(約60μl/玻片),覆蓋parafilm膜,放濕盒中在48~58 ℃下雜交18-30 h。

      3.3雜交后處理

      1O.取出玻片,小心去掉Parafilm膜,甩掉雜交液,用52 ℃預(yù)熱的5×SSC洗30 min。
      11.在無DNA的RNA酶A(20μg/ml)溶液中37 ℃下孵育30 min。
      12.分別依次用52 ℃預(yù)熱的2 X SSC,1 X SSC和O.1 X SSC洗2次,每次30 min。

      3.4雜交信號檢測

      13.在緩沖液A(0.1M Tris-HC 1 pH 7.5,0.15M NaC1)中平衡5min。
      14.在玻片上滴加堿性磷酸酶的抗地高辛抗體(1:500~1:2000稀釋于含0.5%阻斷液的緩沖液A中),室溫反應(yīng)2h。
      15.用緩沖液A洗2次,每次15 min。
      16.在緩沖液B(0.1M Tris-HCl;0.1M NaCl;0.05M MgCl_2,pH 9.5)中平衡5min。
      17.硝基四氮唑藍(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸鹽(BCIP)溶于緩沖液B中,每ml緩沖液B含有4.5μ1 NBT和3.5μ1 BCIP。在玻片上滴加混合染液在濕盒中顯色過夜。
      18.充分顯色后,用EDTA(1 mM EDTA,pH 8.0)洗15 min終止反應(yīng)。
      19.在95%乙醇中洗l h以除去非特異的背景。
      20.用蒸餾水洗15 min除去可能存在的結(jié)晶體。
      21.脫水、透明,用中性樹膠封片。
      22.充分干燥后在顯微鏡下觀察、照相。

       

       

       
      推薦圖文
      推薦食品專題
      點擊排行
       
       
      Processed in 0.189 second(s), 19 queries, Memory 0.88 M