1.組織前處理在組織制片中以冷凍切片(厚10~30μm)最佳。切片貼在預(yù)先清潔,高溫處理并涂以粘附劑載玻片上,先在37℃預(yù)干燥4h,然后置于37℃烤箱中過夜。經(jīng)過上述處理的切片如在-20℃可保存2~3周,在-70℃可保存數(shù)月之久,有報(bào)告可保存數(shù)年之久的。但仍以新鮮制片為好。如為石蠟包埋切片,應(yīng)脫蠟經(jīng)梯度酒精入水。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在細(xì)胞內(nèi)mRNA含量高時(shí)應(yīng)用二甲苯脫蠟后仍能顯示。經(jīng)水洗后入37℃烤箱4h或過夜,然后進(jìn)行雜交前處理。
在烘烤及低溫保存時(shí),為防塵埃及空氣中RNA酶的污染,宜用錫箔紙(foilpaper)包被,內(nèi)加少許干燥劑(變色硅膠)。
下列步驟所需玻璃器皿均需消毒,操作者需戴手套。
(1)PBS洗2×3min。
。2)選擇少數(shù)幾張切片作為“RNA酶對(duì)照片”。
其它切片暫放于PBs 內(nèi)。
RNA酶對(duì)照片處理方法:加RNA酶(100μg/ml)在預(yù)熱37℃的溶液內(nèi)。放在潮濕的盛有少許2×SSC塑料盒或蒸發(fā)皿內(nèi)。在每張切片上覆以過量的RNA酶溶液,在37℃孵育30min后用2×SSC沖洗,2×3min,然后與其它保存在PBS的切片一起進(jìn)行下列處理。
。3)蛋白酶K消化:將組織切片放在0.1mol/l Tris/50mmo/L EDTA pH8.0,內(nèi)含蛋白酶K1μg/ml,孵育15~20min。消化時(shí)間應(yīng)根據(jù)組織的種類,厚度反復(fù)試驗(yàn)調(diào)整。時(shí)間過短探針不易進(jìn)入,過長(zhǎng)影響細(xì)胞或組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
。4)0.1mol/L甘氨酸/PBs 5min終止蛋白激酶K反應(yīng)。0.25%乙酸酐(0.1mol/l 三乙醇胺配制)10min。
。5)在4%多聚甲醛/PBS3min。
。6)以PBs 漂洗2×3min。
(7)浸入新鮮配制的0.25%乙酸酐(0.1mol/L三乙醇胺配制)10min,以封閉非特異性結(jié)合部位。
。8)2×SSC漂洗15min。
2.雜交以含cRNA探針(0.5ng/ml)的雜交液,按每張切片10~2μl的量覆蓋切片。地高辛配基標(biāo)記的cRNA核酸探針保存濃度為2.5ng/ml,用前稀釋備用。覆以硅化蓋玻片或塑料蠟?zāi)ぃ糜谑⒂猩倭?×SSC溫盒內(nèi)在42℃,16~18h或過夜。
3.顯示
(1)用緩沖液1沖洗雜交后的載片2×3min。
(2)在緩沖液1中10min,室溫以封閉非特異性結(jié)合部位。
。3)拭干切片周圍的載片,注意保持切片濕潤(rùn)。加數(shù)滴抗地高辛抗血清(工作濃度1:500,以緩沖液1稀釋),孵育2h,室溫。
。4)緩沖液1漂洗3×3min。
。5)浸入緩沖液210min室溫。
。6)浸入底物中孵育10~30min(或更長(zhǎng)時(shí)間,視需要而定),底物內(nèi)含顯色BCIP/NBT,室溫。最好用錫箔紙包裹反應(yīng)盒,使顯色在黑暗中進(jìn)行。定期取出切片在顯微鏡下檢測(cè)反應(yīng)強(qiáng)度。根據(jù)反應(yīng)強(qiáng)度決定延長(zhǎng)或終止反應(yīng)。反應(yīng)顏色為紫藍(lán)色。
。7)將切片浸入緩沖液3以終止反應(yīng)。
。8)復(fù)染,可用1%伊紅、1%蘇木精、1%亮綠或5%的焦寧(又稱派咯寧丫)(pyronin 丫)10~30s。
。9)流水洗5~10min,直至水無(wú)色為止。
(10)在切片未干前,以PBS/甘油封固切片,如要永久保存,可以用DPX在蓋片四周封固。為去除水份,在封固前可進(jìn)行梯度酒精脫水,透明,DPX封固,但每步時(shí)間僅需幾秒鐘,時(shí)間過長(zhǎng)易致褪色。