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      氯胺T法注意事項(xiàng)

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

       。1)放射性碘源的選用:無載體的131I或125I均可用于碘化標(biāo)記,但應(yīng)盡量選用新鮮的、比放射強(qiáng)度高的、含還原劑量少的放射性碘源。碘源的比放射強(qiáng)度最好≥50~100mCi/ml,至少也要>30mCi/ml,否則加入碘源的容量要增加,隨著帶入碘源中含有的還原劑(為放射性碘源運(yùn)輸保存所需加入)量也增加,這將會(huì)顯著降低碘利用率及標(biāo)記蛋白比放射強(qiáng)度。放置較久和放射性碘源,一方面因衰變致比放射強(qiáng)度降低,另一方面因水的輻射化學(xué)產(chǎn)物增多(主要是131I源),都會(huì)降低標(biāo)記時(shí)的碘利用率。放射性碘源含還原劑(如Na2S2O5等)量多時(shí),會(huì)抵消氯胺T的作用,降低碘利用率,甚至導(dǎo)致標(biāo)記完全失敗。放射性碘源要用無載體的,標(biāo)記所用全部用具和試劑必須不含碘;只要有極少量的碘的污染,非放射性碘就會(huì)稀釋放射性碘,使放射性碘利用率顯著降低。為了便于放射性防護(hù)和除污染,以及減少射線對蛋白質(zhì)分子的損傷,標(biāo)記投入的放射碘量不宜過大,一般以<5mCi為宜。

        (2)放射性碘與多肽、蛋白質(zhì)用量的比例:這比例對標(biāo)記結(jié)果的影響很大。如上述原因,一般標(biāo)記時(shí)放射性投入量不宜過多,示蹤實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)每次只用1~2mCi,因而放射性碘與多肽、蛋白質(zhì)用量的比值主要靠標(biāo)記時(shí)投入的多肽、蛋白質(zhì)用量來控制。當(dāng)投入的放射碘量一定時(shí),多肽、蛋白質(zhì)用量多(即I/多肽、蛋白質(zhì)比值低),能獲得高碘利用率,但所得標(biāo)記蛋白比放射強(qiáng)度低;相反多肽、蛋白質(zhì)用量少(即I/多肽、蛋白質(zhì)比值高),則碘利用率降低,但所得標(biāo)記多肽、蛋白比放射性隨此比值變化都有較大的變動(dòng);而當(dāng)此比值<1后,則碘利用率再下降的幅率較小,標(biāo)記多肽、蛋白比放射性也不會(huì)再增加多少。

       。3)氯胺T與偏重亞硫酸鈉的用量及碘化反應(yīng)時(shí)間:氧化碘化標(biāo)記法中,會(huì)導(dǎo)致失活的最主要原因是氧化還原。氯胺T是氧化劑,早期用氯胺T法作碘化標(biāo)記時(shí)氯胺T用量都比較大,或碘化反應(yīng)時(shí)間較長,結(jié)果導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性的嚴(yán)重?fù)p傷。氯胺T用量大,或長時(shí)間進(jìn)行碘化反應(yīng),結(jié)果并不能使碘利用率和標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)比放射強(qiáng)度提高多少,反而使標(biāo)記多肽、蛋白活性下降。當(dāng)用不含還原劑或還原劑很少的放射性碘源時(shí),試以各種蛋白質(zhì)(包括白蛋白、球蛋白、ACTH、胰島素等)作微量標(biāo)記,當(dāng)氯胺T用量為20μg/0.1ml反應(yīng)液、0~20。C反應(yīng)20s,碘利用率都已接近或達(dá)到最大峰,再加大氯胺T用量和延長反應(yīng)時(shí)間是沒有必要的。隨放射性碘源中還原劑增多,氯胺T用量也應(yīng)增加,以達(dá)到預(yù)期的碘利用率,但決不應(yīng)盲目加大氯胺T用量和延長碘化反應(yīng)時(shí)間(通常反應(yīng)時(shí)間不要超過1min),否則會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)嚴(yán)重失活,不能用于實(shí)驗(yàn)。當(dāng)然,減少氯胺T用量要在了解放射性碘源還原劑含量的基礎(chǔ)上,否則碘源中還原劑量較多,雙盲目減少氯胺T用量,就會(huì)使標(biāo)記失敗。一般用125I標(biāo)記時(shí),氯胺T用量要適當(dāng)加大。加入氯胺T后必須迅速混勻,以防標(biāo)記不均勻。氯胺T與偏重亞硫酸鈉溶液要新配制的。

        氯胺T用量減少了,Na2S2O5用量也就可以隨之減少。為保證按時(shí)終止碘化反應(yīng),實(shí)驗(yàn)時(shí)加入Na2S2O5一般都是過量的。氯胺T用量大時(shí),加入Na2S2O5的剩余量也就會(huì)隨之增加,這就可能加重某些對還原劑敏感的蛋白質(zhì)或多肽生物活性的損傷。為此,Na2S2O5用量也不應(yīng)過多。只要藥品沒有變質(zhì)、試劑是新配的,以重量計(jì)算Na2S2O5加入量與氯胺T相同就足以保證終止碘化反應(yīng)(按反應(yīng)克分子濃度計(jì)算,Na2S2O5/氯胺T重量比約0.4),不要盲目加大用量,并應(yīng)迅速將標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)從反應(yīng)液中分離出來,以盡量減少多肽、蛋白質(zhì)活性的損傷。

        某些蛋白質(zhì)或多肽對氯胺T較敏感,還可進(jìn)一步減少氯胺T用量、縮短碘化反應(yīng)時(shí)間、降低反應(yīng)溫度,以保護(hù)蛋白質(zhì)的活性。這對一些較容易喪失活性蛋白質(zhì)或多肽的碘標(biāo)記十分重要。

       。4)碘化反應(yīng)體積:系指加入Na2S2O5終止反應(yīng)前液體的總量。碘化反應(yīng)體積愈小,局部反應(yīng)物濃度愈高,所得碘利用率和標(biāo)記多肽、蛋白比放射強(qiáng)度就愈高。所以,標(biāo)記應(yīng)采用比放射標(biāo)記效果。當(dāng)反應(yīng)液量少(<0.2~0.3ml)時(shí),反應(yīng)體積對碘利用率和標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)比放射強(qiáng)度的高低影響較大;當(dāng)反應(yīng)液量大(>0.5~1.0ml)時(shí)則影響較小。微量氯胺T法放射碘標(biāo)記時(shí),一般多控制碘化反應(yīng)體積<100μl。

       。5)碘化反應(yīng)溫度:溫度升高,碘化反應(yīng)速度加快,碘利用率有所增加。但總的來看,反應(yīng)溫度的影響不很大,一般從0℃到20℃碘利用率相差不過百分之幾,故一般在室溫下進(jìn)行標(biāo)記操作就可能獲得重復(fù)性好的結(jié)果。有些蛋白質(zhì)或肽類極易喪失活性,則可在0℃進(jìn)行碘化反應(yīng)。

       。6)碘化反應(yīng)的pH值:受氧化劑氧化生成的活性碘,對多肽鏈的酪氨酸基苯環(huán)羥基鄰位的碘化作用,最適pH是7.3~7.8之間。當(dāng)pH變化時(shí),碘化位置也會(huì)發(fā)生變化,例如pH值較高時(shí),組氧酸的咪唑環(huán)也可被碘化;當(dāng)pH4~5時(shí),活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羥基吲哚,導(dǎo)致肽鏈斷裂。這些都會(huì)影響蛋白質(zhì)或多肽的放射性碘化反應(yīng),或引起降解或失活。因此作放射性碘化標(biāo)記時(shí),除放射性碘源外,所有的試劑都應(yīng)用適當(dāng)?shù)木彌_液配制,保證碘化反應(yīng)在最佳pH條件下進(jìn)行。

       。7)微量蛋白質(zhì)或多肽的吸附損失:界面的吸附損失,在使用大量蛋白質(zhì)或多肽類時(shí)是可以忽略的,但作微量法標(biāo)記時(shí)投入的蛋白質(zhì)或多肽類只在微克甚至毫克甚至毫微克水平,界面吸附導(dǎo)致的損失就不能忽略。例如制備131I—ACTH時(shí),所用ACTH濃度低到50Pg/ml時(shí),因表面吸附可損失10%~30%,甚至高達(dá)75%。改變pH、加入非特異性載體蛋白、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器時(shí),能減少吸附,但不能完全消除。一般殘留在反應(yīng)管和滴管上的放射性為投入總放射性的2%~8%、殘留在層析柱上折占5%~10%。殘留量隨標(biāo)記蛋白比放射性強(qiáng)度而直線增減,殘留者幾乎全部都是標(biāo)記蛋白。由此可見,微量蛋白質(zhì)或多肽受吸附而損失的量是不容忽略的。由于微量蛋白質(zhì)、多肽會(huì)被顯著吸附而丟失,所以標(biāo)記時(shí)投入蛋白質(zhì)、多肽量過微(如<2μg)也是不適宜的,否則標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽的收回率會(huì)太低,并在計(jì)算上會(huì)造成較大的誤差。

        (8)不同蛋白質(zhì)、多肽碘化標(biāo)記的差別:由于不同的蛋白質(zhì)和多肽分子中含有的酪氨酸數(shù)目不同,而且其空間結(jié)構(gòu)也不相同,分子中的酪按酸殘基有的容易發(fā)生碘化反應(yīng),有的就不容易碘化,因此同樣條件下進(jìn)行碘化標(biāo)記,不同蛋白質(zhì)或多肽對碘的利用率是不相同的。不同蛋白質(zhì)經(jīng)碘化標(biāo)記后生物活性受損的情況也各不相同。例如ACTH、促性腺激素釋放激素(GRH)、促黃體激素釋放激素(LRH)等多肽,碘化標(biāo)記后容易喪失激素活性或與受體結(jié)合的活性;而AFP及人絨毛膜促性腺激素(HCG)等的碘化標(biāo)記,則較容易保存良好的免疫化學(xué)活性。

        盡管不同多肽、蛋白度的碘化標(biāo)記結(jié)果有所差別,但上述討論的因素對不同多肽、蛋白質(zhì)碘化標(biāo)記的影響有共同的規(guī)律。掌握了這些因素,就容易成功地獲得合格的標(biāo)記物。

        不同多肽、蛋白質(zhì)的分子量大小、理化性質(zhì)各不相同,放射碘化標(biāo)記反應(yīng)后,可根據(jù)具體情況采取不同的方法將標(biāo)記蛋白質(zhì)(或多肽)與未反應(yīng)的游離放射性碘及受損傷的標(biāo)記物分開,常用的方法有凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析、各種電泳法等。

       

       

       
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