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      DNA的酶切與連接

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-02
          (1)在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl,10×Buffer 1μl,DNA 2μl,酶1μl,混勻,37℃水浴1h以上。
         (2)取反應(yīng)物點(diǎn)樣,觀察酶切效果。
       。3)酶切完全后,70℃5min終止反應(yīng)。
       。4)加2倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇和1/10體積的3mol/l NaAc混勻,-20℃2h以上。
        (5)15000rpm離心15min,棄上清。
        (6)加入75%乙醇洗滌2次,離心棄上清,真空抽干。
        (7)加入適量1×TE溶解。如此可得線性化載體DNA。
       。8)測(cè)定DNA的含量。
       。9)加入線性載體DNA和含量3~4倍于載體的待插入DNA片段,連接緩沖液及T4連接酶適量至總體積為20μl,在12~14℃反應(yīng)12~16h。
       。10)連接反應(yīng)液可置-20℃保存,供轉(zhuǎn)化用。
       

       

       
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