1.缺口平移 該技術(shù)由Kelly等于1970年創(chuàng)立。其原理是首先用DNA酶在雙鏈DNA探針分子的一條鏈上制造一些缺口(nick ),缺口處會形成3’—羥基末端,這時再在大腸桿菌DNA聚合酶I的催化下將核苷酸殘基加在3’-羥基上,同時,根據(jù)大腸桿菌酶DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性,此酶將缺口5’側(cè)核苷酸依次切除。其結(jié)果是在缺口平移(nick tr-anslation)。根據(jù)這個原理,如果用高強度的放射性核苷酸(通常為α-32PdATP)置換先前存在的核苷酸,則可制備比活性高達108cpm(每分鐘計數(shù))/μg的32P標記DNA。用缺口平移法標記的DNA探針能滿足大多數(shù)雜交要求。
2.DNA快速末端標記 大腸桿菌DNA聚合酶i 經(jīng)枯草桿菌蛋白酶切割可得到兩條多肽鏈,其中分子量為76kd的大片段稱為Klenow片段。該酶具有完整聚合酶I的5’→3’聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性,但缺乏5’→3’核酸外切酶活性。利用Klenow片段可以填補由限制酶消解DNA所產(chǎn)生的3’凹陷末端。因此,用這種方法可以標記雙鏈DNA的凹陷3’末端。用Klenow片段標記末端一般只用一種[α-32P]dNTP,加入反應的[α-32P]dNTP取決于DNA末端延伸的5’末端序列,例如,用Ecor I切割DNA所產(chǎn)生的末端用[α-32P]dNTP標記。標記反應可在一種限制酶消解DNA后立即進行,不需去除限制酶或使其失活,也不需更換緩沖液,具有3’延伸的DNA末端不能被Klenow片段有效在標記,欲標記這類分子可用T4DNA聚合酶。
選用這種標記方法是為了產(chǎn)生可用于凝膠電泳時作大小參照物的DNA片段。因為標記的DNA片段與其摩爾濃度成比例,而不與片段大小成比例,在限制酶消化物中,小的和大的片段都以相同程度被標記。因此,可使用放射自顯影術(shù)確定不有被溴化乙錠染色所觀察到的大小DNA帶,尤其適用于Southern吸印雜交時分子量標志物的標記。通過選擇相應標記的dNTP,該法還可以只標記DNA分子的一端。例如,若DNA片段的兩個末端分別是Bam H I和Hind III 粘膜端,在反應中只加入[α-32P]dNTP或[α-32P]dGTP,使可選擇性標記兩末端之一。
3.用T4多核苷酸激酶標記DNa 5’末端 寡核苷酸探針或短的RNA和DNA探針可選用此法標記,寡核苷酸探針一般多用這種標記。T4多核苷酸激酶(polynucleotide kinase, PNK)是由T4噬菌體感染的大腸桿菌中提取的,此酶能催化ATP的γ-磷酸轉(zhuǎn)移至DNA或RNA的5’-OH末端。在過量ADP存在時,也可促進磷酸交換反應,使PNK將DNA末端5’磷酸轉(zhuǎn)移到ADP上生成ATP,然后催化[α-32P]dNTP上的標記磷酸轉(zhuǎn)移至DNA的5’末端,從而使DNA重新磷酸化,并藉此得到標記。顯然,PNK標記DNA末端需要[γ-32P]dNTP,這與前述酶促標記方法不同。通常,對于5’磷酸化的DNA探針,要先用堿性磷酸酶去掉磷酸基團,然后再用于PNK催化的5’末端標記,這樣標記效率較高。
4.隨機引物延伸 這是以單鏈DNA或RNA模板合成高比活性32P標記探針所選用的方法。原理是使長6~8nt的寡核苷酸片段與變性的DNA或RNA模板退火,在DNA聚合酶I或反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,以每一個退火到模板上的寡核苷酸片段為引物引發(fā)DNA鏈的合成,在反應時將[α-32P]dNTP摻入合成鏈,即得到標記。變性處理后,新合成鏈(探針片段)與模板解離,即得到無數(shù)各種大小的探針DNA。因為所用寡核苷酸片段很短,在低溫條件下可與模板DNA隨機發(fā)生退火反應,因此被稱為隨機引物(random primer)。這種隨機引物可用小牛胸腺DNA或魚精DNA制備。
用隨機引物法標記的DNA探針或cDNA探針比活性顯著高于缺口平移法,且結(jié)果較為穩(wěn)定。這種方法尤其適用于真核DNA探針,因為隨機引物來自真核DNA,其與真核序列的退火率要高于原核序列。因此,對于克隆的DAN探針,常先將插入探針DNA切下來回收后再標記,而缺口平移法可直接用于全質(zhì)粒的標記。
5.聚合酶鏈反應 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)是一種分子生物學新技術(shù),由美國Cetus公司人類遺傳學部的Kary.B. Mullis于1985年創(chuàng)立。該技術(shù)利用兩個與相反鏈雜交并隨著于靶DNA兩側(cè)的寡核苷酸引物經(jīng)酶促合成特異的DNA片段,包括模板變性,引物退火和引物延伸三個步驟的反復循環(huán),最終兩引物所夾靶DNA得到千萬倍以上的擴增。因此 ,PCR技術(shù)已成為一項極為有價值的技術(shù)并已迅速推廣應用。
PCR技術(shù)有許多重要用途,其中之一便是可用來標記高比活性DNA探針。PCR技術(shù)具有很高的特異性,可在1~2h之內(nèi)在量合成探針DNA片段,如果在底物中加入[α-32P]dNTP或其它標記的dNTP,則探針DNA合成過程中可得到很好的標記,標記物的摻入率可高達70%~80%。因此,PCR標記技術(shù)特別適用于大規(guī)模檢測和非放射性標記。該法的缺點是要合成一對特異性PCR引物。使用從探針DNA上制備的小片段作引物也能取得較好的標記效果。