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      質(zhì)粒載體的粘端DNA連接

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-02

      (1)用適當(dāng)?shù)南拗泼赶|(zhì)粒和外源DNA。如有必要,可用凝膠電泳分離片段并(或)用堿性磷酸酶處理質(zhì)粒DNA。通過酚:氯仿抽提和乙沉淀來純化DNA,然后用TE(pH7.6)溶液使其濃度為100/ml。
      (2)按如下所述設(shè)立連接反應(yīng)混合物:
      a.將0.1μl載體DNA轉(zhuǎn)移到無菌微量離心管中,加等摩爾量的外源DNA。
      b.加水至7.5μl,于45℃加溫5分鐘以使重新退炎的粘端解鏈,將混合物冷卻到0℃。
      c.加入:10xT4噬菌體DNA連接酶緩沖液 1μl
      T4噬菌體NDA連接酶 0.1Weiss單位
      5mmol/L ATP 1μl
      于16℃溫育1-4小時(shí)
      10xT4噬菌體DNA連接酶緩沖液
      200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)
      50mmol/K MgCl2
      50mmol/L二硫蘇糖醇
      500μg/ml牛血清白蛋白(組分V.Sigma產(chǎn)品)(可用可不用)
      該緩訓(xùn)液應(yīng)分裝成小份,貯存于-20℃。
      另外,再設(shè)立兩個(gè)對照反應(yīng),其中含有(1)只有質(zhì)粒載體;(2)只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足,每個(gè)連接反應(yīng)可用50-100ng質(zhì)粒DNA,并盡可能多加外源DNA,同時(shí)保持連接反應(yīng)體積不超過10μl?捎弥辽伲撤N不同方法來測定T4噬菌體DNA連接酶的活性。大多數(shù)制造廠商(除New England Biolabs公司外)現(xiàn)在都用Weiss等,11968)對該酶進(jìn)行標(biāo)化。1個(gè)Weiss單位是指在37℃下20分釧內(nèi)催化1mmol32P從焦磷酸根置換到[γ,β-32P]ATP所需酶時(shí),1個(gè)Weiss單位相當(dāng)于0.2個(gè)用外切核酸酶耐受試驗(yàn)來定義的單位(Modrich和Lehman,1970)或者60個(gè)粘端單位(如New England Biolabs公司所定義)。因此,0.015Weiss單位的T4噬菌體DNA連接酶在16℃下30分鐘內(nèi)可使50%的λ噬菌體HindⅢ片段(5μg)得以連接。在本書中,T4噬菌體DNA連接酶一律用Weiss單位表示。\par 目前提供的T4噬菌體DNA連接酶均為濃溶液(1-5單位/μl),可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫蘇糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50%甘稀釋成100單位/ml的濃度置存。處于這種濃度并在這種緩沖液中的T4噬體DNA連接酶于-20℃保存3個(gè)月可保持穩(wěn)定。
      (3)每個(gè)樣品各。保μl轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

       

       

       
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