cDNA(complementary DNA)是指互補于mRNA的DNA分子。cDNA是由RNA經(jīng)一種稱為逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)的DNA聚合酶催化產(chǎn)生的,這種逆錄酶是Temin等在70年代初研究致癌RNA病毒時發(fā)現(xiàn)的。該酶以RNA為模板,根據(jù)堿基配對原則,按照RNA的核苷酸順序合成DNA(其中U與A配對)。這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反,故稱反向轉(zhuǎn)錄或逆轉(zhuǎn)錄。攜帶逆轉(zhuǎn)錄酶的病毒侵入宿主細胞后,病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下轉(zhuǎn)化成雙鏈cDNA,并進而整合人宿主細胞染色體DNA分子,隨宿主細胞DNA復(fù)制同時復(fù)制。這種整合的病毒基因組稱為原病毒。在靜止?fàn)顟B(tài)下,可被復(fù)制多代,但不被表達,故無毒性。一旦因某種因素刺激而被活化,則該病毒大量復(fù)制,如其帶有癌基因,還可能誘發(fā)細胞癌變,后來發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶不僅普遍存在于RNA病毒中,而且哺乳動物的胚胎細胞和正在分裂的淋巴細胞也含有逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶的作用是以dNTP為底物,RNA為模板,tRNA(主要是色氨酸t(yī)RNA)為引物,在Trna3’-OH末端上,5’-3’方向,合成與RNA互補的DNA單鏈,稱為互補DNA(cDNA),單鏈cDNA與模板RNA形成RNA-DNA雜交體。隨后在逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H活性作用下,將RNA鏈水解成小片段。cDNA單鏈的3’末端回折形成一個小引物末端,逆轉(zhuǎn)錄酶又以第一條cDNA鏈為模板再合成第二第cDNA鏈,至此,完成逆轉(zhuǎn)錄全過程,合成雙鏈cDNA。
逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)在已成為一項重要的分子生物學(xué)技術(shù),廣泛用于基因的克隆和表達。從逆轉(zhuǎn)錄病毒中提取的逆轉(zhuǎn)錄酶已商品化,最常用的有AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。利用真核Mrna3’末端存在一段聚腺苷酸尾,可以合成一段寡聚胸苷酸(oligo(dT))用作引物,在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成互補于mRNA的cRNA鏈,然后再用RNase H將mRNA消化掉,再加入大腸桿菌的DNA聚合酶I催化合成另一條DNA鏈,即完成了從mRNA到雙鏈DNA的逆轉(zhuǎn)錄過程。
所得到的雙鏈cDNA分子經(jīng)S1核酸酶切平兩端后接一個有限制酶切點的接頭(linker),再經(jīng)特定的限制酶消化產(chǎn)生粘性末端,即可與含互補末端的載體進行連接。常用的克隆載體是λ噬菌體DNA,如λgt,EMBL和Charon系列等。用這類載體可以得到包含104以上的轉(zhuǎn)化子的文庫,再經(jīng)前面介紹的篩選方法篩選特定基因克隆。用這種技術(shù)獲得的DNA探針不含有內(nèi)含子序列。因此尤其適用于基因表達的檢測。