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      siRNA表達(dá)載體

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01

      多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴(lài)RNA聚合酶III 啟動(dòng)子(pol III)中的一種,操縱一段45—50nt的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(small hairpin RNA, shRNA)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá),shRNA在細(xì)胞內(nèi)會(huì)自動(dòng)被加工成為siRNA,從而引發(fā)基因沉默或者表達(dá)抑制。這一類(lèi)啟動(dòng)子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動(dòng)子和人H1啟動(dòng)子等。采用RNA pol III啟動(dòng)子的原因是由于它有明確的啟始和終止序列,總是在離啟動(dòng)子一個(gè)固定距離的位置開(kāi)始轉(zhuǎn)錄合成RNA,遇到4—5個(gè)連續(xù)的U即終止,并且轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在第二個(gè)尿嘧啶處被切下來(lái),非常精確,而且還可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RNA。轉(zhuǎn)錄出的RNA形成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)后,會(huì)在3’端形成2個(gè)突出的尿嘧啶,這類(lèi)似于天然的siRNA,因而有利于雙鏈RNA誘發(fā)RNAi。要使用這類(lèi)載體,需要訂購(gòu)2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈,退火后克隆到相應(yīng)載體的pol III 啟動(dòng)子下游?寺〉倪^(guò)程需要幾天的時(shí)間,也需要經(jīng)過(guò)測(cè)序以保證克隆的序列是正確的。

      先在體外構(gòu)建能表達(dá)雙鏈RNA的載體,再將載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)在細(xì)胞內(nèi)合成出雙鏈RNA,不但能增加有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞的種類(lèi),而且在長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞株中,雙鏈RNA能夠長(zhǎng)期發(fā)揮阻斷基因的作用。

      現(xiàn)在有多個(gè)報(bào)道說(shuō)通過(guò)質(zhì)粒表達(dá)siRNAs同樣可以抑制特定基因的表達(dá)。當(dāng)這種帶有PolIII 啟動(dòng)子和shRNA編碼序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí),這種能表達(dá)siRNA的質(zhì)粒確實(shí)能夠下調(diào)特定基因的表達(dá),抑制范圍包括外源基因和內(nèi)源基因。

      腺病毒是體內(nèi)轉(zhuǎn)基因的常用載體。Xia HaiBin等用腺病毒做載體,在體內(nèi)和體外表達(dá)dsRNA,并成功的阻斷了基因的表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)了成體動(dòng)物的基因敲除。

      最近多個(gè)廠(chǎng)家開(kāi)始研究逆轉(zhuǎn)錄病毒和其他病毒載體用于siRNA表達(dá),其優(yōu)勢(shì)在于可以直接高效率感染細(xì)胞進(jìn)行基因沉默的研究,避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來(lái)的種種不便。

      主要優(yōu)點(diǎn):

      1.是唯一可以進(jìn)行長(zhǎng)期研究的方法。雙鏈RNA只能短暫抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因表達(dá),而具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA能夠增加阻斷基因表達(dá)的時(shí)間。在小鼠畸胎瘤細(xì)胞,胚胎干細(xì)胞,C2C12細(xì)胞中,用長(zhǎng)鏈具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA有效的阻斷了報(bào)告基因的表達(dá),在穩(wěn)定表達(dá)具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA的細(xì)胞株中,報(bào)告基因的表達(dá)被長(zhǎng)期的阻斷了。帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá),持續(xù)數(shù)星期甚至更久。即使是對(duì)轉(zhuǎn)染帶有篩選標(biāo)記質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)篩選,也有助于富集帶質(zhì)粒的細(xì)胞。這也可以幫助解決一些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞由于轉(zhuǎn)染效率低造成的問(wèn)題。

      2.由于質(zhì)?梢詮(fù)制擴(kuò)增,相比起化學(xué)合成來(lái)說(shuō),能夠顯著降低制備siRNA的成本。

      適用:已知一個(gè)有效的siRNA序列,需要維持較長(zhǎng)時(shí)間的基因沉默,或者需要用抗生素篩選能表達(dá)siRNA的細(xì)胞。長(zhǎng)期研究。
      不適用:篩選siRNA序列(其實(shí)主要是指需要多個(gè)克隆和測(cè)序等較為費(fèi)時(shí)、繁瑣的工作)。

       

       

       
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