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      玻片PCR

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01
      在聚丙烯管中可以對(duì)多種含膜板材料進(jìn)行PCR,而在顯微玻片上用組織細(xì)胞涂片或切片直接進(jìn)行DNA擴(kuò)增的方法就稱(chēng)為玻片PCR(Slide-PCR)。
        先將細(xì)胞涂片或呈單層細(xì)胞,然后用甲醇/醋酸(3:1,V/V)、Carnoy溶液、無(wú)水乙醇或4%多聚甲醛溶液固定5~15min。用蒸餾水沖洗,干燥,直接使用或保存于-20℃?zhèn)溆。在玻片上?0mm×28mm為免疫組化反應(yīng)區(qū)。加入30μl PCR反應(yīng)混合液,其中含10mmol/L Tris pH8.3,50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,200μmol/l dNTPs,100nmol/L引物,0.01%(V/V)明膠,0.2% BSA, 2.5u/100μl Taq酶。然后蓋上22mm×40mm的蓋玻片,邊緣用石蠟油封好。把玻片放入PCR熱循環(huán)儀金屬塊上,使金屬塊與樣品呈最大程度接觸,同在聚丙烯管中一樣,進(jìn)行30~40個(gè)循環(huán)。對(duì)于較短的擴(kuò)增片段在后期循環(huán)中變性溫度可降低。反應(yīng)后,將致冷玻片放在氯仿中除去大部分石蠟油,但不取出蓋玻片,用一個(gè)尖鑷子輕輕拈起蓋玻片一角,在相對(duì)的一角中PCR反應(yīng)混合液呈半月形液面,用移液器回收。一般可回收25μl混合液,將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳或用套式PCR引物按標(biāo)準(zhǔn)PCR進(jìn)行重新擴(kuò)增。片上擴(kuò)增物可做原位雜交顯示。
        在Slide-PCR中,需0.1%~1%的BSA。加入BSA可以保證擴(kuò)增結(jié)果,但效率不一定很高。明膠(至少0.0001%),對(duì)擴(kuò)增1kb左右的靶DNA十分重要。但對(duì)小片段擴(kuò)增結(jié)果影響不大。不同的樣品提取方法或固定法對(duì)Slide-PCR都可行。
        Silde-PCR的機(jī)理可能是在起始變性過(guò)程中一部分DNA從細(xì)胞中洗提出來(lái),然后在細(xì)胞和玻片的水相中進(jìn)行PCR。用地高辛標(biāo)記的人全基因組DNA探針雜交表明在起始循環(huán)中DNA極微量,而30個(gè)循環(huán)后很豐富。常規(guī)細(xì)胞染色表明只有少量的形態(tài)改變。
        Silde-PCR對(duì)于玻片上的細(xì)胞樣品提供了一種較好的方法,而不必再把這些樣品從玻片上括下來(lái),使操作簡(jiǎn)便,污染減少。本方法對(duì)于原樣品量極微且需病史追蹤保存的(如子宮頸涂片或涂片)具有實(shí)用價(jià)值。
       

       

       
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