PCR技術(shù)類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合;③引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。
PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行,使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量可用Y=(1+X)n計算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù),X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率,n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%,但在實際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期,靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式,隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累,被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加,而進(jìn)入線性增長期或靜止期,即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”,這種效應(yīng)稱平臺期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩。大多?shù)情況下,平臺期的到來是不可避免的。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個引物鏈5’端之間,是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的,以一個原始模板為例,在第一個反應(yīng)周期中,以兩條互補的DNA為模板,引物是從3’端開始延伸,其5’端是固定的,3’端則沒有固定的止點,長短不一,這就是“長產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后,引物除與原始模板結(jié)合外,還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時,由于新鏈模板的5’端序列是固定的,這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點,保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加,而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加,幾乎可以忽略不計,這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化,就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。
PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行,使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量可用Y=(1+X)n計算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù),X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率,n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%,但在實際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期,靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式,隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累,被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加,而進(jìn)入線性增長期或靜止期,即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”,這種效應(yīng)稱平臺期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩。大多?shù)情況下,平臺期的到來是不可避免的。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個引物鏈5’端之間,是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的,以一個原始模板為例,在第一個反應(yīng)周期中,以兩條互補的DNA為模板,引物是從3’端開始延伸,其5’端是固定的,3’端則沒有固定的止點,長短不一,這就是“長產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后,引物除與原始模板結(jié)合外,還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時,由于新鏈模板的5’端序列是固定的,這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點,保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加,而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加,幾乎可以忽略不計,這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化,就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。