DNA經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶消化和凝膠電泳后,放入堿性溶液中使其變性,將變性后的單鏈DNA從凝膠中按原來(lái)位置和順序用濾紙吸印轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,然后再與標(biāo)記探針雜交。此方法比較準(zhǔn)確地保持了特異DNA序列在電泳圖譜中的位置,而且能測(cè)定分子量。
試劑:變性液:0.5mol/L NaOH, 1.5mol/L NaCl
中和液:1mol/L Tris-HCl, 1.5mol/L NaCl pH8.0
20×SSC:0.3mol/L檸檬酸鈉,3mol/L NaCl
1.電泳
取DNA約5μg加限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切,電泳鑒定酶切完全后, 取酶消化后的DNA點(diǎn)樣于0.8%~1.2%的凝膠上,以0.8~1V/cm電壓電泳過(guò)夜,在溴酚藍(lán)離凝膠前緣0.5cm處停止電泳。將電泳后的凝膠翻轉(zhuǎn),紫外燈照射10~20min后拍照。
2.變性與中和
將電泳后的凝膠放入變性液中25℃振蕩60min。
蒸餾水洗膠1min,將凝膠放入中和液中25℃振蕩60min。
3.轉(zhuǎn)移
取托盤(pán)一只,放入10×SSC溶液約500~1000ml,托盤(pán)上搭一塊比凝膠稍寬的長(zhǎng)方形玻璃,取一長(zhǎng)方形濾紙搭在橋上,兩邊浸入10×SSC溶液中,仔細(xì)去掉玻璃與濾紙之間的氣泡(用玻棒在濾紙上滾動(dòng))。將凝膠放在濾紙上,去掉凝膠與濾紙之間的氣泡。將硝酸纖維膜放入2×SSC溶液中浸濕后放在凝膠上(如NC膜浸濕不均勻,則考慮更換NC膜,操作時(shí)手切勿觸及NC膜),去掉凝膠與NC膜之間的氣泡。將一張濾紙(長(zhǎng)和寬均比NC膜小1mm)放在NC膜上,仔細(xì)去掉氣泡。將吸水紙切成與濾紙大小,重疊放在濾紙上,再壓一重物約500~1000g。轉(zhuǎn)膜24h,中間更換吸水紙。
4.固定
用2×SSC溶液洗膜5min去掉殘余凝膠,讓膜自然晾干。將凝膠放入EB液中30min,取出在UV燈下觀察是否有DNA殘余。80℃烤膜2h,然后將膜封入塑料袋進(jìn)行雜交。