一、RAPD技術(shù)的原理

RAPD技術(shù)是由美國的Williams等人于1990年發(fā)明的。它是以聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR技術(shù))為基礎(chǔ)，利用人工合成的寡核苷酸為引物，以從組織中分離出來的基因組DNA為模板，通過基因放大器合成多態(tài)性DNA片段的一種方法。由于不同品種DNA序列存在著差異，其引物結(jié)合位點(diǎn)以及兩結(jié)合位點(diǎn)之間的距離都有差異，這樣經(jīng)PCR擴(kuò)增后就產(chǎn)生了DNA片段的多態(tài)性，從而形成了RAPD標(biāo)記。RAPD標(biāo)記具有以下特點(diǎn)：

⑴、標(biāo)記數(shù)量多，因?yàn)镽APD分析所用引物的數(shù)量是無限的，所以它可以覆蓋基因組中所有的位點(diǎn)。

⑵、標(biāo)記所需模板DNA量小，因此不受季節(jié)、組織、器官及發(fā)育時(shí)期的限制。

⑶、所用引物沒有物種限制，一套引物可以用于不同生物基因組分析。

⑷、分析方便、快速、無需克隆自卑、同位素標(biāo)記、Southern轉(zhuǎn)移等復(fù)雜的操作。

⑸、標(biāo)記是顯性的，因此不能區(qū)別生物個(gè)體是純合型還是雜合型。

目前，RAPD技術(shù)已廣泛用于基因定位，尋找特定基因的連鎖標(biāo)記，物種識(shí)別，系統(tǒng)進(jìn)

化，遺傳多樣性檢測，遺傳作圖和遺傳育種等眾多領(lǐng)域。

由于RAPD技術(shù)是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的，因此為了更好的掌握RAPD技術(shù)，有必要先了解PCR技術(shù)。

1、 PCR技術(shù)的原理

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)簡稱PCR技術(shù)，是近年發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段

的技術(shù)，此法操作簡單，可在短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)百萬個(gè)特異序列的拷貝，因此PCR技術(shù)雖然問世時(shí)間僅數(shù)年，但它已迅速滲透到分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。在分子克隆、遺傳病的基因診斷、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)等方面得到了廣泛的應(yīng)用。

PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的復(fù)制過程十分類似，為在模板DNA、引物（16bp以上，最好為20~24bp）和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。按照反應(yīng)的特點(diǎn)可將其分為三步：①、變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙連解開形成單鏈；②、退火：當(dāng)溫度突然降低時(shí)由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜的多，而且反應(yīng)體系中引物DNA量大大多于模板，使引物和其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補(bǔ)的機(jī)會(huì)較少；③、延伸：在DNA聚合酶和4種脫氧核苷三磷酸底物及Mg2 存在的條件下，由DNA聚合酶5’→ 3’的聚合酶活性催化以引物為起點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)。以上3步為一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物均可作為下一個(gè)循環(huán)的模板，數(shù)小時(shí)之后，介于兩個(gè)引物之間的特異性DNA片段將得到大量的復(fù)制，數(shù)量可達(dá)到2×106~7拷貝。

2、 RAPD的原理

RAPD技術(shù)通常是利用一系列（通常數(shù)百個(gè)）不同堿基順序隨機(jī)排列的寡聚核苷酸單鏈

（通常為10bp）為引物，對(duì)所研究基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同，但對(duì)于任一一對(duì)特定的引物（可相同也可不同），如它們同基因組DNA序列有其特定的結(jié)合位點(diǎn)，這些特定的結(jié)合位點(diǎn)在基因組某些區(qū)域內(nèi)的分布如符合PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件，即引物在模板的兩條鏈上有互補(bǔ)位置，且引物3’端相距在一定的長度范圍之內(nèi)（200~2000bp），就可擴(kuò)增出DNA片斷。因此如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA片斷插入、缺失或堿基突變就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點(diǎn)分布發(fā)生相應(yīng)的變化，而使PCR產(chǎn)物增加、缺失或發(fā)生分子量的改變。通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測即可測出基因組DNA在這些區(qū)域的多態(tài)性，由于進(jìn)行RAPD分析時(shí)可用引物數(shù)很大，雖然對(duì)每一對(duì)引物而言其檢測基因組DNA多態(tài)性的區(qū)域是有限的，但是利用一系列引物則可以使檢測區(qū)域幾乎覆蓋整個(gè)基因組，因此RAPD可以對(duì)整個(gè)基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測。兩個(gè)物種的個(gè)體之間，親緣關(guān)系越接近，其相應(yīng)的PCR擴(kuò)增帶型也就越相似，反之則差異也就越懸殊。

二、多態(tài)性DNA隨機(jī)放大的條件

大多在Williams等（1990）的基礎(chǔ)上變動(dòng)。一般每一個(gè)樣品的最后混合液為25ul，其中

含25ul 10×的DNA聚合酶緩沖液（由Tris-HCl，KCl，MgCl2和明膠等配成），各占100umol/L的dATP、dGTP、dCTP和dTTP，0．2umol/L的引物，20~25ng的模板DNA和0．5單位酶量的DNA聚合酶，然后用蒸餾水將混合物加到25ul。

三、影響RAPD的因素

1、引物

引物的合成是隨機(jī)的，但要滿足以下兩個(gè)條件：G C的含量不低于40%，5’與3’端的堿

基順序非反方向?qū)ΨQ，否則就無法合成專一的少數(shù)幾條DNA片段。引物的長度以10bp為佳，引物太短（＜9bp）易從模板上脫落，聚合反應(yīng)難以進(jìn)行，引物太長，成本提高，合成多態(tài)性DNA片段的可能性降低。

引物的濃度通常是0．2umol/L，這一濃度足以完成40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，引物濃度過高可能導(dǎo)致錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的幾率，這兩者均可競爭酶、Dntp和引物。但如引物濃度不足，則PCR的效率極低，擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量太低。

2、Taq DNA聚合酶：

酶在70℃~75℃時(shí)具有最高的活力，此溫度下每一個(gè)酶蛋白分子每秒可延伸約150個(gè)核苷酸，溫度升高（＞80℃）或降低（＜70℃）時(shí)，聚合酶延伸速度明顯下降。該酶具有良好的熱穩(wěn)定性，95℃保溫2小時(shí)，活性未見明顯損失。

該酶具5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活力，但無3’→5’的外切酶活力，因此，如PCR反應(yīng)中發(fā)生某些核苷酸的錯(cuò)配，該酶沒有校正功能。

該酶為Mg2 依賴性酶，MgCl2濃度在2．0mmol/L時(shí)酶活力最高，Mg2 濃度偏高，酶活力受抑制。由于Mg2 能與負(fù)離子或負(fù)離子團(tuán)（如磷酸根等）結(jié)合，在PCR反應(yīng)中模板DNA、引物及dNTP均可與Mg2 結(jié)合，尤以dNTP的影響最大，所以MgCl2濃度在不同反應(yīng)體系中應(yīng)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整，一般反應(yīng)中Mg2 濃度至少應(yīng)比dNTP總濃度高出0．5~1．0mmol/L。

KCl的最適濃度是50mmol/L，高于75mmol/L時(shí)PCR反應(yīng)明顯抑制，均衡的dNTP有利于酶活性的發(fā)揮，并能減少錯(cuò)配和獲得多量的特異性DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。

在25ul反應(yīng)體系中，聚合酶的用量為1~2U，根據(jù)擴(kuò)增片斷的長度及復(fù)雜程度（G C含量）不同而有所區(qū)別，使用聚合酶濃度過高，可引起非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增，濃度過低，則合成的產(chǎn)物量減少。

3、底物（dNTPs）

dNTPs溶液應(yīng)在-20℃存放，過多的凍融會(huì)使dNTPs降解。在RAPD反應(yīng)中，dNTPs濃

度系在飽和濃度(200umol/L)下使用，dNTPs濃度過高可加快反應(yīng)速度，同時(shí)還可增加堿基的錯(cuò)誤摻入率和實(shí)驗(yàn)成本，反之，低濃度的dNTPs會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度的下降，但可提高試驗(yàn)的精確性。4種dNTPs在使用時(shí)必須以等當(dāng)量濃度配制，以減少錯(cuò)配誤差和提高使用效率，此外，由于dNTPs可能與Mg2 結(jié)合，因此，應(yīng)注意Mg2 濃度和dNTPs濃度之間的關(guān)系。

4、反應(yīng)的緩沖液

緩沖液成分：50 mmol/L KCl 10 mmol/L Tris-HCl （室溫下pH=8．4）

1．5mmol/L MgCl2

緩沖液中能影響反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增片斷的產(chǎn)率，在一般的PCR反應(yīng)中，1．5~2．0mmol/L是比較合適的（對(duì)應(yīng)dNTP濃度為200umol/L左右），Mg2 過量能增加非特異擴(kuò)增并影響產(chǎn)率。由于Mg2 的最佳作用濃度相當(dāng)?shù)�，因此所制備的模板DNA中不應(yīng)含有高濃度的鰲合劑，如EDTA，不應(yīng)含有高濃度的帶負(fù)電荷的離子基團(tuán)，如磷酸根。

緩沖液中的BSA和明膠對(duì)酶起保護(hù)作用。KCl在50mmol/L時(shí)能促進(jìn)引物退火，大于此濃度時(shí)將會(huì)抑制TaqDNA聚合酶的活性。10~50mmol/L Tris-HCl，pH8．4，起調(diào)節(jié)pH使TaqDNA聚合酶的作用環(huán)境維持偏堿性。

5、RAPD的循環(huán)參數(shù)

PCR擴(kuò)增是由變性、退火、（復(fù)性）和延伸三個(gè)步驟反復(fù)循環(huán)組成的。其中每一步的溫度、時(shí)間以及循環(huán)次數(shù)等參數(shù)是非常重要的。

⑴、變性

一般選擇94℃，30s~1min，可使各種復(fù)雜的DNA分子完全變性。應(yīng)根據(jù)模板DNA的復(fù)雜程度，調(diào)整變性溫度和時(shí)間。對(duì)GC含量高的DNA，應(yīng)用較高的變性溫度和時(shí)間。若變性不充分，會(huì)影響PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量，反之若過度變性（溫度過高，時(shí)間過長）會(huì)對(duì)TaqDNA聚合酶活性和dNTP分子造成損壞。RAPD反應(yīng)由于用基因組DNA，因此變性時(shí)間稍長為1min。

⑵、退火

由于RAPD的引物短，因此退火溫度應(yīng)比常規(guī)PCR溫度（50℃）低，為36℃，溫度過高會(huì)引起引物從模板上脫落。退火時(shí)間也比常規(guī)PCR(30s)長，為1min30s，以利于引物與模板DNA的牢固結(jié)合。

⑶、延伸

延伸溫度應(yīng)選擇在70~75℃之間，此時(shí)，TaqDNA聚合酶具最高活力。RAPD反應(yīng)由于引物過短，延伸溫度不利過高，否則不利于引物與模板的結(jié)合。RAPD中可采用使反應(yīng)溫度緩慢升高到70~75℃的方法，因?yàn)樵谧畛踺^低溫度下，DNA聚合酶已催化延伸反應(yīng)開始（1．5個(gè)bp/s），接下來的較高溫度不會(huì)對(duì)這種延伸過的引物和DNA模板的結(jié)合發(fā)生影響。延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，一般1分鐘延伸足以完成2kb的序列，擴(kuò)增片段在2kb以上，則需加長延伸時(shí)間。RAPD反應(yīng)由于擴(kuò)增片段的長度是隨機(jī)的，有可能有2kb以上的片段，因此延伸時(shí)間比常規(guī)PCR(1min)長，為1min30s。

⑷、循環(huán)次數(shù)

RAPD一般為35~40個(gè)，循環(huán)次數(shù)的選擇主要取決于模板DNA的濃度，濃度高，則循環(huán)次數(shù)可降低，過高的循環(huán)次數(shù)（＞40次），則會(huì)增加非特異性產(chǎn)物的量及其復(fù)雜度。

5、模板

RAPD反應(yīng)由于引物序列短，擴(kuò)增片段隨機(jī)，因此為獲得理想的結(jié)果，除模板中不應(yīng)含有高濃度的EDTA和鹽離子外，對(duì)模板的純度要求甚高，OD260/OD280最好在1．8，OD260/OD230 ＞2．0，工作濃度一般為50~100ng。

此外，如模板為環(huán)狀，則應(yīng)先將其線狀化，因閉環(huán)DNA的擴(kuò)增效率低。