RT-PCR實(shí)驗(yàn)有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：
1.做RT前必需測(cè)RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄體系對(duì)RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不會(huì)出太大問題。
3. PCR，按常規(guī)。但如需擴(kuò)長片段，則對(duì)前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2 濃度、退火溫度能解決的。

1）RT和PCR時(shí)的引物設(shè)計(jì)是不是一定要先知道目的基因的序列？必須

在RT時(shí)，引物設(shè)計(jì)有3種方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特異的下游引物。如果用a和b方法，是擴(kuò)增的所有的cDNA（理論上），還要用此產(chǎn)物做PCR 的模板繼續(xù)擴(kuò)增。

如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？http://www.ncbi.nlm.nih.gov

問題：
在做RT-PCR遇到一怪現(xiàn)象，即對(duì)同一動(dòng)物不同組織擴(kuò)增同一段基因，結(jié)果從一種組織中可以擴(kuò)出我的目的基因，條帶非常的好，而另一組織在同樣的條件下卻得到許多非特異性的條帶，嘗試其他條件同樣無法得到滿意的結(jié)果，百思不得其解�。ㄗⅲ阂芽隙ㄔ摶�因在兩種組織中都表達(dá)，且內(nèi)參照在兩種組織都可擴(kuò)增出來）
從這兩種組織中提取的RNA的量是不一樣的，我測(cè)過吸光度，差異還很大，會(huì)不會(huì)和這有關(guān)呢？ 請(qǐng)高手指教！
解答：
1.RT-PCR有兩種做法：
條件具備的話可用kit進(jìn)行一步法進(jìn)行；若條件不太好的話可分兩步進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄再PCR。但后來發(fā)現(xiàn)兩步法的結(jié)果更加理想，條帶特異性強(qiáng)且無拖尾現(xiàn)象，我推測(cè)是體系更加單一比較利于PCR的進(jìn)行，當(dāng)然也可能是我買的kit不太好。（promega）。
2.RT-PCR應(yīng)具備的條件
高質(zhì)量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好產(chǎn)物短點(diǎn)）；若涉及粗略定量的話還應(yīng)考慮RNA的濃度或是cDNA的濃度（如果由內(nèi)標(biāo)分子更好，但我發(fā)現(xiàn)其實(shí)很不容易將RNA的濃度以及內(nèi)標(biāo)分子的表達(dá)量調(diào)整的完全一樣）；體系的均一性等。
3.RACE
我做過RACE（3’RACE是寶生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但現(xiàn)在再進(jìn)行另一個(gè)同源基因的3‘RACE時(shí)卻怎么也P不出來，這兩個(gè)基因是由同一對(duì)引物擴(kuò)增出來的，其中一個(gè)已經(jīng)獲得了全序列（RACE的方法），而另一個(gè)基因的3’UTR卻增么也擴(kuò)不出來，我推測(cè)是不是該基因的3‘UTR太長的緣故，我都快綠了，有無

RT-PCR的常用內(nèi)標(biāo)b－actin 和GAPDH的使用有選擇性嗎？比如不同的細(xì)胞，不同的刺激。

有關(guān)內(nèi)參：
RT-PCR內(nèi)參照可以在一個(gè)管子里做（那樣也是圖好看一些），最好分開兩管，把除了引物之外的mixture統(tǒng)一配，拍照后，算目的基因和內(nèi)參的比值，這就是基因表達(dá)的相對(duì)濃度。

問：我曾經(jīng)作過同一管的PCR，內(nèi)有actin 和目的基因引物。雖然可見到兩條均一條帶但圖片質(zhì)量不理想（而且酶量、Mg2 加倍）。請(qǐng)教mxbdna2003 ，你是如何處理同一管的PCR的各成分的濃度？
答： it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using "accurate piptte" is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.

在同一管中做RT，其實(shí)沒有什么問題，不需要taq魅加量，taq酶本來就是過量的^-^，（平時(shí)做pcr的時(shí)候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八兩就可以了，我想這肯定再很多貼子里應(yīng)該都談到了。Mg就跟不能變了，一變整個(gè)體系就變了。能看到均一條帶就很好了。
關(guān)鍵是摸，十八摸（太少，只爭朝夕，開個(gè)玩笑）雖然用不著，但是摸上3、5摸總是必要的，首先遙分開摸，然后再一起摸，直到摸的好了，還要考慮比較的不同的模板中的量，所以我們不建議再同一管中進(jìn)行，因?yàn)檫�有互相競爭抑制的問題，即使不同基因之間。

有關(guān)內(nèi)參的建議：

一定要做內(nèi)參的，每一次，我想。不作內(nèi)參的結(jié)果是不可信的
電泳可以不一起跑，沒有關(guān)系，計(jì)算的是相對(duì)表達(dá)程度，著我在好幾封帖子里都談了，再說一邊我得觀點(diǎn)，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對(duì)表達(dá)量，不是絕對(duì)表達(dá)量，除非你能準(zhǔn)確知道來自多少細(xì)胞，但是細(xì)胞還有死的呢。2、以電泳為基礎(chǔ)的半定量RT-PCR本身是不可信的，作為實(shí)驗(yàn)的粗篩是可以的，但不能作為最終結(jié)果的，3、半定量RT-PCR應(yīng)該再兩管中進(jìn)行，除非內(nèi)參基因和目的基因表達(dá)相同，長度差不多，GC含量相似，或者實(shí)在窮的要省PCR管和taq。
關(guān)于平臺(tái)期和線性期的問題，實(shí)際上線性期是指數(shù)期，只不過碰巧2的冥和2的倍數(shù)是相同的�？瓷先ト魏我粋�(gè)時(shí)期都可以，實(shí)際上是不對(duì)的，因?yàn)闋可娴矫复賱?dòng)力學(xué)的問題，這個(gè)我也不懂，有一些專門的文章，好像，涉及到很多化學(xué)的東西。我們學(xué)醫(yī)的，也沒必要知道那些，但是其中主要是因?yàn)槟０逡�物酶原料和buffer之間的關(guān)系，這種反應(yīng)單靠改變其中一種成分沒有用的，酶一直是過量，再加酶也沒用，引物ntp都是這樣。煙鬼正傳，最好選線性期的開始階段，但是要在你的凝膠成像分辨范圍內(nèi)，所以選一個(gè)這兩種的契合點(diǎn)。給你一張圖你就明白了，再開始的時(shí)候酸的是切線，這圖我在 *** 帖過。
關(guān)于引物設(shè)計(jì)，再可能的情況下，除了常規(guī)要求之外，最好兼顧跨內(nèi)含子（不過，根據(jù)要求，還可以專門設(shè)計(jì)隔內(nèi)含子的，這樣還可以用于基因組PCR）、長度小于500bp－600bp等等。

引物當(dāng)然要設(shè)計(jì)成一樣的退火溫度，即使不再一管中，也要一樣的，要在一臺(tái)機(jī)器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一個(gè)溫度，這樣任何幾個(gè)都可以拿來披，也不用查。
我反復(fù)說過了，別用軟件，就用眼睛看，軟件涉及的在好，有些基因在它出軟件的時(shí)候，還沒發(fā)現(xiàn)呢，跟不要說在基因組的位置和序列了，怎么考慮內(nèi)含子的問題呢？

18s的引物也和著名的βactin一樣是設(shè)計(jì)的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用總RNA為模板，但是比actin和bubulin等可準(zhǔn)多了，更不要說GAPDH這個(gè)破爛了。18s除了在細(xì)胞中更相同（量）外，主要是它占的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于看家基因，所以定量更加準(zhǔn)確，我想，不知對(duì)不對(duì)，請(qǐng)幾位主任和eeflying指教。我認(rèn)為，就像你用某一種東西的數(shù)量去概括，因該選那種多的東西，說一座房子是由2000塊磚造成的，比說又29根梁更準(zhǔn)確吧。更不要說沒有看家基因不看家的缺點(diǎn)，因?yàn)樗�是服�?wù)于整個(gè)基因組表達(dá)譜什么的。
PE有專門的用于實(shí)時(shí)PCR的內(nèi)參試劑盒，就是用18s，不過我們看懂使用的那條序列，不知有沒有人用過，告知其序列和genbank號(hào)。
正好問一下，我查了一些序列，一直沒有去合成，主要是因?yàn)槭稚系腶ctin的熒光探針還沒有完，當(dāng)初和成了一堆。
有那位高手用過18s的內(nèi)參，請(qǐng)問您的序列（我指的是模板的序列）？
原位雜交最好用RNA做探針，效果好一些，反正你有錢賣roche的盒子，而且量也能保證，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄過程嘛，沿著一條線突突地跑就是了。正義反義也容易理清。

我覺得做RT-PCR的方法和條件及應(yīng)注意的事項(xiàng)就是那么幾條,許多專業(yè)書都有詳細(xì)的描述,但是許多人還是歷經(jīng)多次磨難，有時(shí)就是得不出結(jié)果。因此，我認(rèn)為因?yàn)槊總�(gè)人所要克隆的片斷不同，引物不同等，因此對(duì)不同的人來說還是有他自己的特殊性,我的以下經(jīng)歷說明：做實(shí)驗(yàn)時(shí)各人的情況不同,做不出時(shí)還是要好好動(dòng)一下腦子。
記得我開始我的ＲＴ－PCR時(shí)，按常規(guī)方法，提取總ＲＮＡ后，首先用自己設(shè)計(jì)的下游引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，不斷改變反應(yīng)條件，進(jìn)行了Ｎ次均沒有結(jié)果。后來考慮到本人的克隆的PCR的片斷位于我們實(shí)驗(yàn)另一位同學(xué)克隆的片斷當(dāng)中，而該同學(xué)已經(jīng)用RT-PCR克隆出她的片斷（盡管她用這些ＲＴ－ＰＣＲ產(chǎn)物做模版再進(jìn)行ＰＣＲ時(shí)也沒辦法重復(fù)出她的產(chǎn)物），因此，我先用她的引物和條件擴(kuò)增出她的片斷，然后用她的ＲＴ－ＰＣＲ產(chǎn)物作模板（有點(diǎn)改進(jìn)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)換用了９mers隨機(jī)引物），用我的引進(jìn)物進(jìn)行一般PCR，終于得到我的產(chǎn)物，測(cè)序結(jié)果完全正確。盡管我的這個(gè)經(jīng)歷別人很人遇到，但足可以說明實(shí)驗(yàn)可以有自己的模式，書本的知識(shí)和別人的經(jīng)驗(yàn)很重要，但有時(shí)也不定要受到書本框框和別人經(jīng)驗(yàn)的限制

請(qǐng)問：
1 引物的特異退火溫度怎樣設(shè)定？可以根據(jù)gc 和at含量算出嗎？可以用引物報(bào)告單上的Tm值嗎？
2 PCR時(shí)20微升體系中cDNA應(yīng)加多少比較合適？MgCl2應(yīng)加多少？各個(gè)成分的量有無確定標(biāo)準(zhǔn)？
3 PCR結(jié)果跑電泳，actin有，但跑不出目的條帶，有幾種原因？與cDNA的量少有關(guān)嗎？Mg離子太多是否會(huì)抑制Taqase的活性？

一般來說引物報(bào)告單傷得是對(duì)的,也可以自己算,實(shí)際上重要的各條引物一致,剩下的可以摸的.
20中是指體積還是量?只要不明顯改變體系的離子強(qiáng)度,加1,2ul都可以的.mg要調(diào)的,但我總覺得沒有書里講的那么玄乎,我都是常年不變的.
如果內(nèi)參照有,目的沒有,至少證明不是"美麗惹"的禍.原因書里應(yīng)該都說了.

在所有RNA實(shí)驗(yàn)中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，一般反應(yīng)不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會(huì)引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。
在實(shí)驗(yàn)中，一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用的RNA酶也會(huì)造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細(xì)胞中則含有大量內(nèi)源性的RNA酶。
一、 防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時(shí)間。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
3. 有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。
4. 配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。
5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過程中手套要勤換。
6. 設(shè)置RNA操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。
二、常用的RNA酶抑制劑
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。
2. 異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。
3. 氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用。
mRNA的分離與純化
真核細(xì)胞的mRNA分子最顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有5’端帽子結(jié)構(gòu)（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。絕大多數(shù)哺乳類動(dòng)物細(xì)胞mRNA的3’端存在20-30個(gè)腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A ）表示。這種結(jié)構(gòu)為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標(biāo)志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。
mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A ）的特點(diǎn)，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時(shí)或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。
寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA
一、試劑準(zhǔn)備
1．3M醋酸鈉（pH 5.2）
2．0.1M NaOH
3．1×上樣緩沖液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸鈉。配制時(shí)可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至65℃時(shí)，加入經(jīng)65℃溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%。
4．洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS
5．無水乙醇、70%乙醇
6．DEPC
二、操作步驟
1．將0.5-1.0g寡聚（dT）-纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。
2．用DEPC處理的1ml注射器或適當(dāng)?shù)奈�管，將寡聚（dT）-纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的DEPC H2O洗柱。
3．使用1×上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。
4．將RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2×上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當(dāng)RNA上樣液全部進(jìn)入柱床后，再用1×上樣緩沖液洗柱，繼續(xù)收集流出液。
5．將所有流出液于65℃加熱5min，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。
6．用5-10倍柱床體積的1×上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測(cè)定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其內(nèi)含物為無Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或無吸收。
7．用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫P(yáng)oly(A )RNA，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。
8．OD260測(cè)定Poly(A )RNA分布，合并含Poly(A )RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc（pH5.2）、2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，混勻，-20℃放置30min。
9．4℃離心，10000g×15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。[注意：此時(shí)Poly(A )RNA的沉淀往往看不到]。4℃離心，10000g×5min，棄上清，室溫晾干。
10. 用適量的DEPC H2O溶解RNA。
三、注意事項(xiàng)
1．整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程必須防止Rnase的污染。
2．步驟（4）中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個(gè)，一個(gè)是破壞RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，尤其是mRNA Poly(A )尾處的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使Poly(A )尾充分暴露，從而提高Poly(A )RNA的回收率；另一個(gè)目的是能解離mRNA與rRNA的結(jié)合，否則會(huì)導(dǎo)致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。
3．十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降，會(huì)阻礙柱內(nèi)液體流動(dòng)，若室溫低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
4．寡聚（dT）-纖維素柱可在4℃貯存，反復(fù)使用。每次使用前應(yīng)該依次用NaOH、滅菌 ddH2O、上樣緩沖液洗柱。
5．一般而言，107哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞能提取1-5μg Poly(A )RNA，約相當(dāng)于上柱總RNA量的1%-2%。
RNA酶保護(hù)試驗(yàn)((RNase Protection Assay,RPA)是通過液相雜交的方式,用反義RNA探針與樣品雜交，以檢測(cè)RNA表達(dá)的技術(shù)。與Northern雜交和RT-PCR比較，RPA有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：
1． 檢測(cè)靈敏度比Northern雜交高。由于Northern雜交步驟中轉(zhuǎn)膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進(jìn)行電泳，故損失小，提高了靈敏度。
2． 由于PCR擴(kuò)增過程中效率不均一和反應(yīng)“平臺(tái)”問題，基于PCR產(chǎn)物量進(jìn)行分析所得數(shù)據(jù)的可靠性將下降，而RPA沒有擴(kuò)增過程，因此，分析的數(shù)據(jù)真實(shí)性較高。
3． 由于與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進(jìn)行分析。
4． 步驟較少，耗時(shí)短。與Northern雜交相比，省去了轉(zhuǎn)膜和洗膜的過程。
5． RNA-RNA雜交體穩(wěn)定性高，無探針自身復(fù)性問題，無須封閉。
6． 一個(gè)雜交體系中可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)探針雜交，無競爭性問題。
7． 檢測(cè)分子長度可以任意設(shè)置，靈活性大。
RPA的缺點(diǎn)是需要同位素標(biāo)記探針。
一、試劑準(zhǔn)備
1． GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。
2. 雜交緩沖液 IPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。
3. RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、RNase A(10mg/ml) 8μl、RNase T1(250U/μl) 1μl，加DEPC H2O至2ml
二、操作步驟
1．反義RNA可由含T7或SP6啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒為模板制備，也可以用含啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物為模板制備，本文介紹后者。
（1）設(shè)計(jì)含T7啟動(dòng)子的PCR引物
由于PCR產(chǎn)物將作為合成反義RNA的模板，所以一對(duì)引物中的下游引物5’-端要含T7啟動(dòng)子序列:

T7啟動(dòng)子序列為：5’-TAATACGACTCACTATAGGG

引物設(shè)計(jì)的其他要求與一般PCR引物的設(shè)計(jì)相同。PCR產(chǎn)物的長度決定了反義RNA探針的長度，具體設(shè)計(jì)時(shí)可考慮100-400bp長。最好采用巢式PCR，即先擴(kuò)增出一較長的片段，再以該片段為模板擴(kuò)增出較短的片段，以保證探針的特異性，如下圖所示：

上游引物

下游引物Ⅱ T7 啟動(dòng)子序列

下游引物Ⅰ

（2）PCR

先用上游引物和下游引物Ⅰ進(jìn)行PCR，再以PCR 產(chǎn)物為模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7進(jìn)行二次PCR(具體操作參見PCR章節(jié))。

（3）探針合成標(biāo)記與純化

在0.5ml 離心管中加入下列試劑：

RNasin （40U/μl） 0.5μl

GACU POOL GAC

（含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM） 2μl

[α-32P]UTP(10μCi/μl) 2.5μl

DTT (二硫蘇糖醇，0.1M) 1μl

5×轉(zhuǎn)錄 buffer 2μl

模板（50ng/μl） 1μl

T7 RNA 聚合酶 (15U) 1μl

混合后，短暫離心，37OC保溫1hr。

加入DNaseⅠ（10U/μl）1μl, 37OC 15min, 然后75 OC 10min以滅活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。

加入：飽和酚 50μl

氯仿 50μl

酵母tRNA（2μg/μl） 4μl

DEPC H2O 100μl

室溫下充分混勻，離心10000g×2min。取上層液置另一0.5 ml離心管中，加入100μl氯仿，混勻，離心10000g×2min。將上層液轉(zhuǎn)移至另一0.5ml 離心管中，再加入3M NaAc 10μl、預(yù)冷無水乙醇250μl，混勻后，-20OC靜置30min。4OC離心13500g×10min。棄上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗滌，4OC離心13500g×2min, 棄上清液。室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇。加入50μl雜交緩沖液溶解沉淀，4OC下保存待用�？捎媚蛩�-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)探針質(zhì)量。（參見本節(jié)電泳步驟）。

2．雜交

（1） RNA提取后溶解在雜交緩沖液中，濃度為1μg/μl。

（2）取8μl RNA加入1-3μl探針（根據(jù)探針檢測(cè)結(jié)果調(diào)整）于0.5ml 離心管中。

（2） 80OC保溫2min，然后40-45OC下雜交12-18hr。

3. 消化

(1) 雜交管于37 OC保溫15min，加入RNase消化液，37 OC保溫30min。

(2) 加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混勻，37 OC保溫10min。

(3) 加入65μl飽和酚和65μl氯仿，混勻，室溫離心，10000g×2min。

(4) 轉(zhuǎn)移上層液到另一0.5離心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl異丙醇，混勻后，置-20OC 30min，4 OC離心,135000g×10min。

(5) 棄上清液，室溫下?lián)]發(fā)乙醇，加入5-8μl上樣緩沖液溶解沉淀。

4、電泳與放射自顯影

（1）配制凝膠：(50ml)

40%丙烯酰胺-亞甲雙丙烯酰胺（19：1） 6.25ml

5×TBE 10ml

尿素 24g

加H2O至50ml

溶解后加入25%過硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混勻，注入電泳槽中，插入梳，待膠凝固。

（2）預(yù)電泳

以1×TBE為上下槽電泳緩沖液，加上電壓后進(jìn)行預(yù)電泳，如果用測(cè)序電泳裝置，電壓應(yīng)達(dá)2000v以上，功率設(shè)定為100w，溫度設(shè)為50 OC。待膠板溫度達(dá)50 OC時(shí)，暫停電泳，準(zhǔn)備加樣。

（3）加樣

將已溶解在加樣緩沖液中的樣品80 OC加熱2min，立即加樣到膠孔中，電泳1-2hr。（電泳條件同預(yù)電泳）。

（3） 電泳結(jié)束后，打開膠板，用濾紙取下膠，覆上一層保鮮膜，放置于暗盒中，暗室紅光下，壓上一張X片，蓋上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光結(jié)束后，將X光片顯影、定影、水洗、晾干。

三、注意事項(xiàng)

1．本實(shí)驗(yàn)大部分為RNA操作，注意RNA酶的污染。

2．RNase消化液消化未雜交的單鏈RNA和探針RNA，當(dāng)探針與樣品之間有堿基錯(cuò)配時(shí)，錯(cuò)配位點(diǎn)也將被消化，因此會(huì)產(chǎn)生片段較小的雜交片段。因此進(jìn)行PCR時(shí)，采取盡量減少錯(cuò)配的措施。

3、 同位素對(duì)RNA合成有一定影響，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生非全長的探針。因此，標(biāo)記時(shí)間不宜過長。

4、 RNase消化液有時(shí)會(huì)產(chǎn)生過度消化而無檢測(cè)信號(hào)，可以將消化液稀釋10-100倍后使用。

　
可能問題出在標(biāo)本的保存：一般四小時(shí)之內(nèi)就應(yīng)處理，分離出細(xì)胞
說的是套式PCR,可以在你的第一次PCR兩個(gè)引物內(nèi),再設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行第二次PCR就行了
如果你的第一次PCR剛好包括目的片段,那只好設(shè)計(jì)個(gè)更長的了
第二次的引物設(shè)計(jì)要求可以低一點(diǎn)
以50μl體系為例
引物各1μl
第一次PCR產(chǎn)物5μl

二次PCR和巢式PCR，即設(shè)計(jì)兩對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，不是一個(gè)概念，它是拿第一次的PCR產(chǎn)物，稀釋100-1000倍做模板，加入底物，從新進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以期增加產(chǎn)物的量

我做RT-PCR時(shí),提總RNA時(shí),都是用滅菌DEPC水,按1:100稀釋后測(cè)OD260和OD280,后根據(jù)公式:RNA濃度=OD260*稀釋度/25(ug/ul),后用1mg total RNA分離mRNA.做逆轉(zhuǎn)錄及PCR,效果很好.

luoyu10 wrote:
各位大哥：
我有一個(gè)問題請(qǐng)教，RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低為多少，如果太低是不是會(huì)影響結(jié)果？

最低到1.8，最好2.0，我感覺稍微低一點(diǎn)影響不算太大。

問：我是ＲＴ－ＰＣＲ的新手，想請(qǐng)教引物如何設(shè)計(jì)？

好的引物所具有的令人滿意的特點(diǎn)：
* 典型的引物18到24個(gè)核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。
* 選擇GC含量為40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。
* 設(shè)計(jì)5'端和中間區(qū)為G或C的引物。這會(huì)增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。
* 避免引物對(duì)3'末端存在互補(bǔ)序列，這會(huì)形成引物二聚體，抑制擴(kuò)增。
* 避免3'末端富含GC。設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或T。
* 避免3'末端的錯(cuò)誤配對(duì)。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
* 避免存在可能會(huì)產(chǎn)生內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列，這會(huì)破壞引物退火穩(wěn)定性。
目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點(diǎn)和啟動(dòng)子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當(dāng)計(jì)算引物Tm值時(shí)并不包括這些序列，但是應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)。
有時(shí)候，僅有有限的序列信箱可供用于引物設(shè)計(jì)。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設(shè)計(jì)簡并引物。簡并引物是指代表編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據(jù)不同生物的堿基使用偏好，減少簡并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對(duì)，降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用簡并堿基，因?yàn)?'端最后3個(gè)堿基的退火足以在錯(cuò)誤位點(diǎn)起始PCR。使用較高的引物濃度（1μM到3μM），因?yàn)樵S多簡并混合物中的引物不是特異性針對(duì)目的模板。

【經(jīng)驗(yàn)】如何確認(rèn)RNA的質(zhì)量
各位都知道，提取到質(zhì)量良好的RNA（包括總RNA和mRNA，以下同）是非常困難，關(guān)于RNA的提取技術(shù)，我就不說了，為什么呢？或許各位非常關(guān)心呢，我是這樣想的，我可以看到的資料或者是廠家的說明書，各位也同樣可以看到的，內(nèi)容當(dāng)然都是一樣的了，所以實(shí)驗(yàn)做的好不好，主要是心的投入多少的問題，所以希望大家自己多多思考��！
以下兩種方法，相信大家都知道的：
1）檢測(cè)RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機(jī)物的值。一般的，我們只看OD260/OD280（Ratio，R）。
1.82.0時(shí)，我們認(rèn)為RNA中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染是可以容忍的，不過要注意，當(dāng)你用Tris作為緩沖液檢測(cè)吸光度時(shí)，R值可能會(huì)大于2（一般應(yīng)該是<2.2的）。當(dāng)R<1.8時(shí)，溶液中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染比較明顯，你可以根據(jù)自己的需要決定這份RNA的命運(yùn)。當(dāng)R>2.2時(shí)，說明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。
如果RNA的量夠，可在260nm（A260）用分光光度法測(cè)定RNA的得率，1個(gè)單位等于40ug/mlssRNA。純RNA的A260/A280的比值為2.0。A260/A230的比值還表明RNA的純度，其值小于2.0表明裂解液中有亞硫氰胍和belta-巰基乙醇?xì)埩�，其值大�?.4，需用乙酸鹽，乙醇沉淀RNA。
2）RNA的電泳圖譜
一般的，RNA的電泳都是用變性膠進(jìn)行的，但是根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，如果你僅僅是為了檢測(cè)RNA的質(zhì)量是沒有必要進(jìn)行如此麻煩的實(shí)驗(yàn)的，用普通的瓊脂糖膠就可以了。
電泳的目的是在于檢測(cè)28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認(rèn)為RNA的質(zhì)量是好的（見下圖）。
以上是我們常用的兩種方法，但是這兩種方法都無法明確的告訴我們RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我們很難察覺，但是大部分后續(xù)的酶學(xué)反應(yīng)都是在37度以上并且是長時(shí)間進(jìn)行的。這樣，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中就會(huì)有非常適合的環(huán)境和時(shí)間發(fā)揮它們的作用了，當(dāng)然這時(shí)你的實(shí)驗(yàn)也就完了。
下面，我們介紹一個(gè)可以確認(rèn)RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。
3）保溫試驗(yàn)
方法很簡單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,并且用pH7.0的Tris緩沖液補(bǔ)充到10 ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
時(shí)間到了之后，取出兩份樣本進(jìn)行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別（當(dāng)然，它們的條帶也要符合方法2中的條件），則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質(zhì)量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染。
如果你的RNA樣本通過了保溫實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)并且你在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中還是非常小心的防范RNA酶的騷擾，那么你的實(shí)驗(yàn)應(yīng)該是很難失敗了！