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      病毒RNA提取protocol

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

      1,用異硫氰酸胍提取
      提禽流感病毒的詳細步驟,可參考(我提過N次做定量PCR都沒問題):
      1.取200ul樣品數(shù) 陰性對照 陽性對照個1.5ml滅菌eppendorf管
      2.加600ul異硫氰酸胍,然后加入對照和樣品,再加200ul氯仿,顛倒混勻
      3.13000rpm離心15min
      4.在第3步離心快結(jié)束時,另取同樣多eppendorf管,加入400ul -20度預冷的異丙醇
      5.取第3步離心的上清(一定不要吸取到中間白色層,第3步離心結(jié)束往外拿的時候,管子盡量不要傾斜)轉(zhuǎn)移到第4步準備的管中,顛倒混勻
      6.13000rpm離心15min,輕輕倒去上清;在吸水紙上盡量沾干液體
      7.加600ul 75%乙醇,顛倒數(shù)次以洗滌殘存異丙醇
      7.13000rpm離心15min,輕輕倒去上清;在吸水紙上盡量沾干液體
      8.4000rpm離心10sec,將管壁殘存液體甩到底部,用微量槍頭吸干,室溫干燥2-3min(不可過分干燥,防止下一步RNA不溶解)
      9.加入20ul DEPE水(加入depc的純水高壓后的水即為DEPE水),輕輕混勻溶解RNA。2000rpm離心5sec,冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ詈?小時內(nèi)使用,以免RNA降解)

      2,用TRIzol LS提取
      應用TRIzol LS提取病毒RNA
      所提取物為血清、血液、細胞培養(yǎng)液、雞胚尿囊液等液體中的病毒。提取時盡量在人少時進行,防止空氣中RNA酶的污染。所用一切物品也應是無RNA酶的。
      1.1 在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul,再加入TRIzol LS 500ul,充分混勻,室溫放置10min。
      1.2 加入200ul的氯仿,蓋緊離心管蓋,用力震蕩離心管(溶液充分乳化,成乳白狀,無分相現(xiàn)象),室溫放置10min (由于氯仿沸點低、易揮發(fā),振蕩時離心管可能爆開,小心)。
      1.3 離心 4℃、13000r/min、15min,取上層液相移入另一管(切忌吸動白色中間相)。
      1.4 加入等體積異丙醇,輕輕顛倒離心管充分混勻液體,室溫放置10min。
      1.5 離心 4℃、13000r/min、15min,(這時乍一看會發(fā)現(xiàn)管子里好像沒有東西,再仔細看看,會發(fā)現(xiàn)靠近管底的壁上有一星點的白色沉淀物,就是它了)用槍小心吸去所有上清。
      1.6 1ml75%乙醇洗一遍,離心 4℃、8000r/min、10min,(這時又會發(fā)現(xiàn)管子沒東西了,不要擔心,有的,但是因為量太少看不見罷了)用槍小心吸去所有上清,在超凈臺中干燥5min。
      1.7 加入適量DEPC處理水。(如果材料來源豐富的話,加入的水量為下一步RT的total減去其他試劑的量;若要省著點用,則自己看著辦了,盡量不要加太多的水)。
      1.8 建議立即做RT。若要保存,可在上一步加入乙醇后凍存于-70℃,可保存一年;若加入DEPC水后則只能在-20℃保存1個月左右。

      3,Trizol法提禽流感病毒protocol
      Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細菌,樣品量從幾十毫克至幾克。
      1、 取雞胚尿囊液,加入5-10倍體積 Trizol液,混勻;
      2、 室溫放置5分鐘,然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,蓋緊離心管,用手劇烈搖蕩離心管15秒;
      3、 取上層水相于一新的離心管,按每ml Trizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇,室溫放置10分鐘,12000g離心10分鐘;
      4、 棄去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,混勻,4℃下7500g離心5分鐘;
      5、 重復第4步;
      6、 小心棄去上清液,然后室溫干燥5-10分鐘,注意不要干燥過分,否則會降低RNA的溶解度;
      7、 然后將RNA溶于水中,放置10分鐘。

      [注意]
      1、 整個操作要帶口罩及一次性手套,并盡可能在低溫下操作。
      2、 加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年

       

       

       
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