蛋白質(zhì)是一切生命活動的基礎(chǔ),受基因表達的調(diào)控,因而以檢測樣品中的mRNA為基礎(chǔ)的cDNA芯片是當今研究中倍受關(guān)注的研究手段。但是,由于存在著轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯調(diào)控以及翻譯后加工等多種調(diào)節(jié)機制,基因的表達,或者說mRNA的水平并不必然代表蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平。因此,以微陣列技術(shù)對生物樣品作整體蛋白質(zhì)表達分析的蛋白芯片在后基因組時代越來越受重視?贵w芯片(Antibody Microarray,抗體微陣列),是蛋白質(zhì)芯片的一種,是檢測生物樣品中蛋白表達模式的新方法。這種新技術(shù)使得研究人員可以在一次實驗中比較生物樣品中成百上千的蛋白質(zhì)的相對豐度,將極大促進蛋白質(zhì)組目前的研究狀況——因為以現(xiàn)有的技術(shù)中對蛋白質(zhì)進行這種復雜的分析是非常困難的。
Clontech公司第一代的抗體芯片Ab Microarray 380(Cat.No.K1847-1)包含固定在玻璃片基上的378種已知蛋白質(zhì)的單克隆抗體,可以在一次簡單實驗中同時檢測樣品中的378種蛋白質(zhì)的表達情況,并且可以在一張芯片上對兩種樣品的表達模式進行比較分析。這使得抗體芯片在毒性實驗、疾病研究和藥物開發(fā)上有廣泛的應用前景。Ab Microarray 380芯片上每個抗體都是并列雙點以增加結(jié)果的可靠性,抗體針對廣泛的胞內(nèi)蛋白和膜結(jié)合蛋白,已知參與信號傳導、癌癥、細胞周期調(diào)控、細胞結(jié)構(gòu)、凋亡和神經(jīng)生物學等廣泛的生物功能,因而可以用于檢測某一特定的生理或病理過程相關(guān)蛋白的表達模式。盡管抗原來自人,但很多抗體可以識別小鼠或大鼠的樣品。詳細的資料可以上網(wǎng)查詢。
芯片上抗體的選擇不但根據(jù)其特異性,也根據(jù)抗體的結(jié)合親和力,在驗證實驗中特異性低、交叉反應高、或者信號強度低的抗體都被排除,另外所有抗體都經(jīng)過檢驗保證得到的信號與抗原濃度有良好的線性相關(guān),那些沒有良好的線性劑量關(guān)系的抗體都被排除。因此抗體芯片能夠檢測到樣品中很低的pg/ml濃度的抗原。
第一代的蛋白芯片和DNA芯片一樣是作為一種定性分析的工具,可用于分析樣品之間相關(guān)蛋白的相對表達豐度;還可以作為DNA芯片的補充,用于研究蛋白和基因表達之間的關(guān)系。
操作流程
抗體芯片并不要求特殊的技能,只要一般常規(guī)的操作就可以完成以往極為復雜耗時的工作。整個操作流程包括:從50—200mg組織或細胞、體液中進行蛋白質(zhì)抽提——用Cy5和Cy3兩種不同顏色的熒光分子分別標記兩個樣品——洗去多余的標記分子——與芯片雜交孵育——掃描分析結(jié)果。整個過程從樣品制備到結(jié)果分析只要一天即可完成,你只要準備好樣品、熒光染料、脫鹽純化柱(處理體液樣品時用)和熒光掃描儀,其他的試劑全部由試劑盒提供。
優(yōu)化的試劑
隨芯片試劑盒提供的蛋白抽提/標記緩沖液,是專門為抗體芯片而設(shè)計的,非常溫和的去垢劑在能高效抽提膜結(jié)合蛋白(相比SDS煮沸法能抽提95%以上的蛋白)的同時能保持蛋白的天然活性(非變性條件),這樣能夠保證抽提的蛋白的溶解性和代表性,保證以后的實驗結(jié)果的真實性,和原始材料的一致性。
Internally Normalized Ratio
根據(jù)操作手冊進行內(nèi)源標準化處理可以得到一個內(nèi)源標準化信噪比(INR),內(nèi)源標準化處理是指對兩個樣品(A、B)中分別用兩種熒光標記分子(Cy3和Cy5)標記,并交叉與芯片雜交(見圖,A-Cy5和B-Cy3一組,A-Cy3和B-Cy5一組分別和芯片雜交),可以作為消除抗原—抗體結(jié)合效率差異的對照,也可以消除潛在的不同熒光分子的標記效率差異。假如Cy5標記效率高于Cy3,單純一個實驗的結(jié)果就會有偏差(Cy5標記的樣品信號偏高),用這種雙向交叉反應就可以消除這種偏差。兩芯片雜交結(jié)果分別得到兩組Ratio值,通過免費下載的工具就可以自動算出每個抗體抗原的INR值,這就代表在兩個樣品間某個蛋白的相對豐度。這種內(nèi)源標準化處理可以大大減小樣品分析的偏差。
抗體芯片檢測的結(jié)果不是蛋白的絕對含量而是378個目的蛋白在兩個樣品之間的相對豐度。值得注意的是由于抗體抗原結(jié)合的差異、標記差異等原因,根據(jù)芯片結(jié)果信號的強弱判斷同一樣品中兩種不同蛋白的多少是不恰當?shù)摹?/p>
特點
* 整個分析過程可以在一天內(nèi)完成
* 用熒光分析的方法比較兩個樣品之間378個蛋白質(zhì)的相對豐度
* 適用于包括組織、細胞系、體液在內(nèi)的多種生物樣品
* 試劑盒提供完整的樣品抽提制備、標記、孵育所需的Buffer,特別設(shè)計的樣品制備的過程能保持樣品的完整性和溶解性,保證制備樣品具有代表性和一致性。
* 芯片上的抗體包含針對信號傳導、癌癥、細胞周期調(diào)控、細胞結(jié)構(gòu)、凋亡和神經(jīng)生物學等廣泛的生物功能的相關(guān)蛋白,跨度大、適用范圍廣。
* 芯片上的抗體分別經(jīng)過特異性抗原、細胞系和組織的檢測,靈敏度高達pg/ml
* 開放性的芯片平臺設(shè)計,可以用各種型號DNA芯片熒光掃描儀進行檢測。