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      凝膠層析技術(shù)

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28
      凝膠層析又稱為分子篩層析或凝膠過濾。具有分子篩作用的物質(zhì)很多,如浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等。以葡聚糖凝膠應(yīng)用最廣,商品名是sephadex型號很多,從G10到G200,它的主要應(yīng)用范圍是:①分級分離各種抗原與抗體;②去掉復(fù)合物中的小分子物質(zhì)。如除鹽、熒光素和游離的放射性同位素以及水解的蛋白質(zhì)碎片;③分析血清中的免疫復(fù)合物;④分子量的測定。
      (一)原理
      凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質(zhì),當(dāng)帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內(nèi)運動時,由于它們的分子量不同而表現(xiàn)出速度的快慢,在緩沖液洗脫時,分子量大的物質(zhì)不能進入凝膠孔內(nèi),而在凝膠間幾乎是垂直的向下運動,而分子量小的物質(zhì)則進入凝膠孔內(nèi)進行“繞道”運行,這樣就可以按分子量的大小,先后流出凝膠柱,達到分離的目的。
      (二)葡聚糖凝膠的種類與性能
      葡聚糖又名右旋糖酐,在它們的長鏈間以三氯環(huán)氧丙烷交聯(lián)劑交聯(lián)而成。葡聚糖凝膠具有很強的吸水性,交聯(lián)度大,吸水性小,相反交聯(lián)度小,吸水性大。商品名以SephadexG表示,G值越小,交聯(lián)度越大,吸水性越小,G值越大,交聯(lián)度越小,吸水性就越大,二者呈反比關(guān)系,G值大約為吸水量的10倍。由此可以根據(jù)床體積而估算出葡聚糖凝膠干粉的用量。
      表 Sephadex1的種類與特性
      型號
      分離范圍
      (分子量)
      吸水量
      (ml/g)
      最小溶脹時(h)
      20℃~25℃ 100℃
      床體積(ml)/干凝膠(mg)
      G10
      <700
      1.0±0.1
      3 1
      2~3
      G15
      <1 500
      1.5±0.2
      3 1
      2.5~3.5
      G25
      <5 000
      2.5±0.2
      3 1
      4~6
      G50
      1500~20 000
      8.0±0.3
      3 1
      9~11
      G75
      3 000~70 000
      7.5±0.5
      24 1
      12~15
      G100
      4 000~15 000
      10.0±1.0
      72 1
      15~20
      G150
      5 000~800 000
      15.0±1.5
      72 1
      20~30
      G200
      5 000~30 0000
      20.0±2.0
      72 1
      30~40
      G25、G50有四種顆粒型號:粗(100µ~300µ)、中(50µ~150µ)、細(xì)(20µ~80µ)和超細(xì)(10µ~40µ)。G75G200又有兩種顆粒型號:中(40µ~120µ),超細(xì)(10µ~40µ)。顆粒越細(xì),流速越慢,分離效果越好。
      表 DEAE-纖維素與Sephadex1比較
      項 目
      DEAE纖維素
      Sephadex
      交換量
      較大
      非特異性吸附
      較大
      分離純度
      較好
      分離時間
      較粗
      較長
      應(yīng)用范圍
      較窄
      較寬
      預(yù)處理
      繁瑣
      方便
      (三)試驗方法
      1.凝膠的選擇 根據(jù)層析物質(zhì)分子量的大小選擇不同型號的凝膠,如除鹽和除游離的熒光素,則可選用粗、中粒度的G28或G500,G250多用于分離蛋白質(zhì)單體,G200多用于分離蛋白質(zhì)凝膠聚合體等。
      2.凝膠的預(yù)處理 稱取適量的凝膠加入過量的緩沖液在冰箱(或室溫)中充分膨脹,或在沸水中煮,膨脹時間應(yīng)根據(jù)不同型號的凝膠而定。
      表 凝膠量與型號和層析柱大小與規(guī)格及凝膠用量
      層析柱規(guī)格
      凝膠的規(guī)格和用量(g)
      直徑(cm)
      高(cm)
      容量(ml)
      G25
      G50
      G100
      G200
      0.9
      15
      9.5
      2.5
      1
      0.6
      0.3
      0.9
      30
      19
      5
      2
      1.2
      0.6
      0.9
      60
      38
      10
      4
      2.5
      1.2
      1.6
      20
      40
      10
      4
      2.5
      1.2
      1.6
      40
      80
      20
      8
      5.0
      2.4
      1.6
      70
      140
      35
      14
      9.0
      4.4
      1.6
      100
      200
      50
      20
      12.5
      6
      2.6
      40
      210
      50
      20
      12
      7
      2.6
      70
      370
      90
      35
      20
      12
      2.6
      2.6
      100
      60
      530
      1 000
      130
      250
      50
      110
      30
      70
      17
      35
      為使粒子均勻一致需進行浮選,即加入凝膠粒子后,輕輕攪拌,靜置20min,傾去沉淀的粒子,如此反復(fù)數(shù)次即可。
      3.裝柱 層析柱的選擇一般根據(jù)分離樣品的種類和樣品的數(shù)量而定。純化蛋白質(zhì)時,柱床體積應(yīng)為樣品體積的25~100倍。去鹽、游離熒光素約為樣品體積的4~10倍。柱太短,影響分離效果。柱長一些,分離效果好,但柱太長,則延長分離時間,樣品也稀釋過度。層析柱的內(nèi)徑也要選擇適當(dāng)。內(nèi)徑過細(xì),會發(fā)生“器壁效應(yīng)”,即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內(nèi)徑和高度應(yīng)有一定的比例。對于除鹽來說應(yīng)為1︰5~1︰25;對于純化蛋白質(zhì)來說應(yīng)為1︰20~1︰100。
      裝柱過程基本同離子交換層析柱。
      4.加樣與洗脫 樣品體積不宜過多,最好為床體積的1%~5%,最多不要超過10%。樣品濃度也不宜過大,濃度過大粘度大,分離效果差,一般不超過4%。
      洗脫液應(yīng)與膨脹一致,否則更換溶劑,凝膠體積會發(fā)生變化,影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強度和pH值。分離血清蛋白常用0.02~0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液(0.14Mol/L NaCl)和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl緩沖鹽溶液(0.14Mol/L NaCl)。
      5.洗脫液收集 同離子交換層析。
      6.凝膠柱的重復(fù)使用與保存 當(dāng)樣品的各組分全部洗脫下來之后,即可加入新的樣品,繼續(xù)使用。保存方法有三種:
      ⑴ 在液相中保存最方便,即于凝膠懸液中加入防腐劑(一般為0.02%N2N3或0.002%洗必泰)或高壓滅菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。
      ⑵ 用完后,以水沖洗,然后用60%~70%酒精液沖洗,凝膠體積縮小,即在半收縮狀態(tài)下保存。
      ⑶ 長期不用者,最好以干燥狀態(tài)保存,即水洗凈后,用含乙醇的水洗,逐漸加大乙醇用量,最后用95%的乙醇洗,可全部去水,再用乙烯去除乙醇,抽濾干,于60℃~80℃干燥后保存。
       

       

       
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