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      熒光原位雜交(FISH)和用引物介導(dǎo)的原位標(biāo)記(PRINS)操作規(guī)程

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

      儀器設(shè)備
      1、 醫(yī)用微波爐;
      2、 水浴鍋;
      3、 OLYMPUS BX51熒光顯微鏡;
      4、 OLYMPUS DP11數(shù)字顯微照相機。

      FISH試劑
      (1)1×PBS:由10×PBS溶液稀釋而成,儲存于4℃;
      (2)20×SSC(pH7.0);
      (3)2×SSC,由20×SSC溶液稀釋而成;
      (4)25mg/ml蛋白酶K消化液。
      (5)變性液(70%甲酰胺 2×SSC,pH7.0):4ml 20×SSC;8ml蒸餾水;28ml甲酰胺。每次新鮮配制。
      (6)雜交后洗滌液: 20×SSC 4ml;蒸餾水16ml;甲酰胺20ml。每次新鮮配制。調(diào)節(jié)pH前升至室溫。

      實驗步驟
      1、脫蠟:
      1)二甲苯脫蠟3次,每次5min;
      2)100%酒精兩次,每次2min;
      3)移出酒精,斜置切片,標(biāo)記末段向下,空氣干燥。
      2、蛋白酶處理:
      1)每個染色缸40ml蛋白酶K消化溶液,配制方法如下:2×SSC 40ml倒人Facal管,在水浴槽中預(yù)熱。將消化酶液加入管內(nèi),搖動直到酶溶解。
      2) 37℃水浴槽中預(yù)熱染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。
      3) ×SSC在室溫下漂洗切片3次,每次1min。
      4)梯度酒精脫水(-20℃預(yù)冷)。
      3、變性:
      1)每一個立式染色缸配制40ml變性溶液;
      2)78℃水浴槽中平衡預(yù)熱混合液染色缸;
      3)78℃孵育8min;
      4) 即移入-20℃預(yù)冷70%酒精的染色缸內(nèi)2min,再依次移入80%、90%和100%的-20℃預(yù)冷酒精內(nèi),每缸2min;
      5)空氣干燥。
      4、雜交:
      1)準(zhǔn)備探針;
      2)取一個較大的濕盒,交叉放置切片;
      3)滴10μl探針在切片的組織上,加蓋玻片;
      4)蓋上濕盒蓋,37℃孵育12h~16h。
      雜交后的水洗:
      5)鑷子小心去除蓋玻片;
      6)43℃預(yù)熱雜交后水洗溶液40ml水洗切片15min;
      7)2×SSC(37℃)洗兩次,每次10min;
      8)切片放人染色缸的1×PBS內(nèi)待檢測,勿使切片干燥。
      檢測:
      9)從1×PBS中取出切片,除去過多的水分,避免標(biāo)本干燥。把切片放入濕盒內(nèi),同時處理4張切片。
      10)每張切片使用30μl~60μl羅丹明抗-地高辛抗體或FITC卵白素,室溫下孵育20min;
      11)去掉塑料蓋膜,把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次,每次2min。
      擴增:
      12)從1×PBS中取出切片,斜置切片使液體排出;
      13)每張切片滴30μl~60μl抗-卵白素抗體,加塑料蓋膜,室溫孵育20min;
      14)去掉塑料蓋膜,把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次,每次2min;
      15)從1×PBS中取出切片,斜置切片使液體排出;
      16)每張切片滴30μl~60μl抗-卵白素抗體,加塑料蓋膜,室溫孵育20min;
      17)1×PBS室溫下洗3次,每次2min。
      5、細(xì)胞核染色:
      1)張切片加10μl~20μl DAPI,覆蓋蓋玻片并在室溫下孵育2~5ml;
      2)盡可能快的在熒光顯微鏡下觀察或封閉盒內(nèi)保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h內(nèi)可以在顯微鏡下觀察。

      PRINS步驟
      1、常規(guī)脫蠟浸入0.01mol/LPBS;
      2、用0.2mol/L鹽酸處理5min;
      3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃ 15min;
      4、分別用80%,95%和100%酒精脫水,室溫干片;
      5、加PCR混合液25μL(10mmol/L Tris-HCl,50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,各加200μmol/L dATP,dCTP,dGTP,1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5μl,引物250ng,Taq DNA聚合酶2U),加蓋片;
      6、94℃變性5min后置入65℃濕盒中5min;
      7、用0.1×SSC液,65℃洗5min;
      8、片于65℃ 10s~20s;用4×SSC-0.1%吐溫20液42℃洗5min,2次;
      9、經(jīng)Buffer I液洗后滴加20%羊血清封閉30min;
      10、加地高辛抗體復(fù)合物(1:500)室溫下2h;
      11、BufferⅢ液洗5min;
      12、用BCIP-NBT顯色1h~2h,在鏡下控制,終止顯色;
      13、用中性紅或核固紅襯染,酒精脫水,二甲苯透明,樹脂封片。

       

       

       
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