摘要 基因重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，由于表達(dá)量高，往往形成無(wú)生物活性的包涵體。包涵體必須經(jīng)過(guò)變性和復(fù)性的過(guò)程才能獲得有活性的重組蛋白。如何提高基因重組蛋白質(zhì)的復(fù)性率，是生物工程技術(shù)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。對(duì)近年來(lái)的重組蛋白質(zhì)的復(fù)性方法做一評(píng)述，為研究蛋白質(zhì)折疊以及復(fù)性技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)。
關(guān)鍵詞 重組蛋白 包涵體 復(fù)性 二硫鍵
到目前為止，人們表達(dá)的重組蛋白質(zhì)已有4000多種，其中用E.coli表達(dá)的蛋白質(zhì)要占90%以上，盡管基因重組技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)提供了嶄新的途徑，然而人們?cè)诜蛛x純化時(shí)卻遇到了意想不到的困難，即這些蛋白質(zhì)在E.coli中絕大多數(shù)是以包涵體形式存在，重組蛋白不僅不能分泌到細(xì)胞外，反而在細(xì)胞內(nèi)聚集成沒(méi)有生物活性的直徑約0.1~3.0μm的固體顆粒[1]。自從應(yīng)用大腸桿菌體系表達(dá)基因工程產(chǎn)品以來(lái)，人們就一直期望得到高活性、高產(chǎn)量的重組蛋白。不可溶、無(wú)生物活性的包涵體必須經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性才能獲得天然結(jié)構(gòu)以及生物活性，因此應(yīng)該選擇一個(gè)合適的復(fù)性過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的正確折疊，獲得生物活性，近年來(lái)的研究可以使復(fù)雜的疏水蛋白、多結(jié)構(gòu)域蛋白、寡聚蛋白、含二硫鍵蛋白在體外成功復(fù)性。

包涵體形成的原因

重組蛋白在宿主系統(tǒng)中高水平表達(dá)時(shí)，無(wú)論是原核表達(dá)體系或真核表達(dá)體系甚至高等真核表達(dá)體系，都會(huì)形成包涵體[2]。主要因?yàn)樵谥亟M蛋白的表達(dá)過(guò)程中，缺乏某些蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中需要的酶和輔助因子，或環(huán)境不適，無(wú)法形成正確的次級(jí)鍵等原因形成的[3]。

1、 表達(dá)量過(guò)高，研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確配對(duì)，過(guò)多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無(wú)法達(dá)到足夠的溶解度等。

2、 重組蛋白的氨基酸組成，一般說(shuō)來(lái)含硫氨基酸越多越容易形成包涵體。

3、 重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體。

4、 重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺少真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。

5、 有報(bào)道認(rèn)為，豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質(zhì)的表達(dá)，當(dāng)培養(yǎng)條件不佳時(shí)，容易形成包涵體。

減少包涵體形成的策略

1、 降低重組菌的生長(zhǎng)溫度，降低培養(yǎng)溫度是減少包涵體形成的最常用的方法，較低的生長(zhǎng)溫度降低了無(wú)活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成[4]。

2、 添加可促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長(zhǎng)添加劑，培養(yǎng)E.coli時(shí)添加高濃度的多醇類、蔗糖或非代謝糖可以阻止分泌到周質(zhì)的蛋白質(zhì)聚集反應(yīng)，在最適濃度范圍內(nèi)添加這些添加劑不會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)的合成或運(yùn)輸，其它促重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長(zhǎng)添加劑還有乙醇（誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細(xì)胞周質(zhì)的還原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成）和NaCl[5]。

3、 供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件，如供氧、pH等。

包涵體的分離及溶解

對(duì)于生物制藥工業(yè)來(lái)說(shuō)，包涵體的形成也是有利的，不僅可獲得高表達(dá)、高純度的重組蛋白質(zhì)，還可避免細(xì)胞水解酶對(duì)重組蛋白質(zhì)的破壞。由于包涵體是蛋白質(zhì)聚集而成的致密顆粒，分離的第一步是對(duì)培養(yǎng)收集的細(xì)胞進(jìn)行破碎，比較有效的方法是高壓勻漿結(jié)合溶菌酶處理，然后5000~20000g離心，可使大部分包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離，接著，包涵體沉淀需用去污劑（Triton X-100或脫氧膽酸鈉）和低濃度變性劑（2mol/L尿素或鹽酸胍等）洗滌除去脂類和膜蛋白，這一步很重要，否則會(huì)導(dǎo)致包涵體溶解和復(fù)性的過(guò)程中重組蛋白質(zhì)的降解[6、7、8]。

包涵體的溶解必須用很強(qiáng)的變性劑，如8mol/L尿素、6~8mol/L鹽酸胍，通過(guò)離子間的相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，異氰鹽酸胍最強(qiáng)；去污劑，如SDS[7]，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白，但由于無(wú)法徹底去除而不允許用在制藥行業(yè)中；酸，如70%甲酸[9]，可以破壞蛋白的次級(jí)鍵從而增溶蛋白，這種方法只適合少數(shù)蛋白質(zhì)。對(duì)于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時(shí)應(yīng)加入還原劑（如DTT、GSH、β-ME）打開(kāi)蛋白質(zhì)中所有二硫鍵，對(duì)于目標(biāo)蛋白沒(méi)有二硫鍵的有時(shí)也應(yīng)使用還原劑，為含二硫鍵的雜蛋白會(huì)影響包涵體的溶解，同時(shí)還應(yīng)加入金屬螯合劑，如EDTA或EGTA，用來(lái)螯合Cu2 、Fe3 等金屬離子與還原狀態(tài)的巰基發(fā)生氧化反應(yīng)[10]。

蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理

包涵體蛋白在變性劑作用下，為可溶性伸展態(tài)，在變性劑去除或濃度降低時(shí)，就會(huì)自發(fā)的從變性的熱不穩(wěn)狀態(tài)向熱力學(xué)穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)變，形成具有生物活性的天然結(jié)構(gòu)[11]。然而在去除變性劑的同時(shí)，重組蛋白質(zhì)在體外折疊，分子間存在大量錯(cuò)誤折疊和聚合，復(fù)性效率往往很低，包涵體蛋白折疊復(fù)性的效率實(shí)際上取決于正確折疊過(guò)程與聚集過(guò)程之間的競(jìng)爭(zhēng)[1]。對(duì)于蛋白質(zhì)的折疊機(jī)制，目前有多種不同的假設(shè)，但很多學(xué)者認(rèn)為有一個(gè)“熔球態(tài)”的中間狀態(tài)，在“熔球態(tài)”中，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)基本形成，其空間結(jié)構(gòu)也初具規(guī)模，再做一些局部調(diào)整就可形成正確的立體結(jié)構(gòu)，總之，蛋白質(zhì)的具體步驟可用下式描述[12、13、14]：

伸展態(tài)→中間體→后期中間體→天然態(tài)體→聚集體

在折疊反應(yīng)中，從伸展態(tài)到中間體的速度是非�？斓�，只需要幾毫秒，但從中間體轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊粦B(tài)的過(guò)程比較緩慢，是一個(gè)限速過(guò)程。聚集過(guò)程與復(fù)性過(guò)程相互競(jìng)爭(zhēng)，故而應(yīng)盡量避免聚集體的產(chǎn)生。一般認(rèn)為，蛋白質(zhì)在復(fù)性過(guò)程中涉及兩種疏水作用，一是分子內(nèi)的疏水相互作用，可促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊；一是部分折疊的肽鏈分子間的疏水相互作用，在復(fù)性過(guò)程中，部分折疊的中間體的疏水簇外露，分子間的疏水相互作用會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集。蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)雖然由其氨基酸的順序決定，然而伸展肽鏈折疊為天然活性結(jié)構(gòu)的過(guò)程還受到周圍環(huán)境的影響，如溫度、pH值、離子強(qiáng)度、復(fù)性時(shí)間等因素的影響。

提高重組蛋白質(zhì)折疊復(fù)性的方法

一個(gè)有效的、理想的折疊復(fù)性方法應(yīng)具備以下幾個(gè)特點(diǎn)：活性蛋白質(zhì)的回收率高；正確復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)分離；折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品；折疊復(fù)性方法易于放大；復(fù)性過(guò)程耗時(shí)較少[15]。

1、 透析、稀釋和超濾復(fù)性法：這三種方法是最傳統(tǒng)也是應(yīng)用最普遍的蛋白質(zhì)折疊復(fù)性方法，復(fù)性活性回收率低，而且難于與雜蛋白分離。透析法耗時(shí)長(zhǎng)，易形成無(wú)活性蛋白質(zhì)聚集體；超濾法在膜上聚集變性，易造成膜污染；稀釋法處理量太大，不利于工業(yè)放大[16]。

2、 高蛋白濃度下的復(fù)性方法：一個(gè)成功的復(fù)性過(guò)程在于能夠在高蛋白濃度下仍能得到較高的復(fù)性率。一個(gè)方法是把變性蛋白緩慢連續(xù)或不連續(xù)地加入到復(fù)性液中[17]。在兩次蛋白加入之間，應(yīng)有足夠的時(shí)間間隔使蛋白質(zhì)折疊通過(guò)了易聚集的中間體階段。這是由于完全折疊的蛋白通常不會(huì)與正在折疊的蛋白一起聚集。第二種方法是用溫度跳躍策略[4]。變性蛋白在低溫下復(fù)性折疊以減少聚集，直到易聚集的中間體大都轉(zhuǎn)化為不易聚集的后期中間體后，溫度快速升高來(lái)促進(jìn)后期中間體快速折疊為蛋白的天然構(gòu)象。第三種方法是復(fù)性在中等的變性劑濃度下進(jìn)行[18]，變性劑濃度應(yīng)高到足以有效防止聚集，同時(shí)又必須低到能夠引發(fā)正確復(fù)性。

3、 添加促進(jìn)劑的復(fù)性方法：包涵體蛋白質(zhì)折疊復(fù)性促進(jìn)劑的促進(jìn)作用可以分為：穩(wěn)定正確折疊蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)、改變錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、增加折疊復(fù)性中間體的溶解性、增加非折疊蛋白質(zhì)的溶解性。通常使用的添加劑有：a、共溶劑：如PEG6000~20000，通過(guò)與中間體特異的形成非聚集的復(fù)合物，可以阻止蛋白質(zhì)分子間的相互碰撞機(jī)會(huì)，減少蛋白質(zhì)的聚集；b、去污劑及表面活性劑：如Trition X-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜堿等對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用，但它們能與蛋白質(zhì)結(jié)合，很難去除；c、氧化-還原劑：對(duì)于含有二硫鍵的蛋白，復(fù)性過(guò)程中應(yīng)加入氧化還原體系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等，氧化還原系統(tǒng)通過(guò)促進(jìn)不正確形成的二硫鍵快速交換反應(yīng)，提高了正確配對(duì)的二硫鍵的產(chǎn)率[19]；d、小分子的添加劑：如鹽酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺類等，都可阻止蛋白聚集，它們的作用可能為：穩(wěn)定蛋白的活性狀態(tài)、降低非正確折疊的穩(wěn)定性、增加折疊中間體的穩(wěn)定性、增加解折疊狀態(tài)的穩(wěn)定性。e、0.4~0.6M L-Arg：L-Arg能使得不正確折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及不正確連接的二硫鍵變得不穩(wěn)定，使折疊向正確方向進(jìn)行，可大幅度地提高包涵體蛋白質(zhì)的折疊效率。f、添加分子伴侶和折疊酶：分子伴侶是指能夠結(jié)合和穩(wěn)定另外一種蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)象，并能通過(guò)有控制的結(jié)合和釋放，促進(jìn)新生多肽鏈的折疊、多聚體的裝配或降解及細(xì)胞器蛋白的跨膜運(yùn)輸?shù)囊活惖鞍踪|(zhì)[20]。折疊酶有二硫鍵異構(gòu)酶、脯氨酸異構(gòu)酶等。分子伴侶和折疊酶都能在體外調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的正確折疊，提高蛋白質(zhì)的合成效率。但這類蛋白在折疊復(fù)性后要除去，而且十分昂貴，因此采用可回收利用的方法如固定化法為好。g、人工伴侶[21]：為模仿分子伴侶而發(fā)展的一種方法：首先，變性蛋白被復(fù)性液中的去污劑捕獲，形成蛋白-去污劑復(fù)合體，復(fù)合體的形成抑制了蛋白的聚集，然后加入環(huán)糊精從復(fù)合體中去除去污劑，使得蛋白質(zhì)正確折疊。h、單克隆抗體[22]：待折疊復(fù)性的蛋白質(zhì)的抗體可有效協(xié)助復(fù)性，但只限于此蛋白才能獲得明顯的助折疊作用。I其它：多聚離子化合物如肝素可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的復(fù)性，具有穩(wěn)定天然蛋白質(zhì)的作用；甘油可以增加黏度，減少分子碰撞的機(jī)會(huì)，減少錯(cuò)配以提高復(fù)性效率；適量的鹽濃度可以降低某些帶電基團(tuán)間的斥力，有利于蛋白質(zhì)的折疊；輔助因子、短鏈醇、高滲物等能有效的降低聚集體的形成，對(duì)蛋白有穩(wěn)定的作用。jklmn

4、 液相色譜（LC）復(fù)性法：液相色譜是一種最有效的純化蛋白質(zhì)的方法，已成為基因重組蛋白質(zhì)純化的必不可少的手段，現(xiàn)有報(bào)道，疏水相互作用色譜（HIC）[23]、離子交換色譜（IEC）[24]、凝膠排阻色譜（SEC）[25]、親和色譜（AFC）[26]已成功的對(duì)變性蛋白進(jìn)行了復(fù)性。與傳統(tǒng)的稀釋法和透析法相比，液相色譜復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)是：在進(jìn)樣后可很快的除去變性劑；由于色譜固定相對(duì)變性蛋白質(zhì)的吸附可明顯的減少、甚至完全消除變性蛋白質(zhì)分子在脫離變性劑環(huán)境后的分子聚集，從而避免了沉淀的產(chǎn)生，提高蛋白質(zhì)復(fù)性的質(zhì)量和活性回收率；在蛋白質(zhì)復(fù)性的同時(shí)，可使目標(biāo)蛋白質(zhì)與雜蛋白分離達(dá)到純化的目的，使復(fù)性和純化同時(shí)進(jìn)行；便于回收變性劑，降低廢水處理成本。4種色譜法，SEC的分離效果是LC中最差的，鹽酸胍會(huì)在IEC柱上保留，與蛋白一起洗脫下來(lái)，AFC使用范圍窄、所需時(shí)間長(zhǎng)、價(jià)格昂貴，HIC是其中較為理想的。變性蛋白在HIC上的復(fù)性機(jī)理為：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)、變性劑和雜蛋白進(jìn)入HIC系統(tǒng)后，由于變性劑在柱子上的作用力較弱，變性蛋白質(zhì)的作用力較強(qiáng)，變性劑首先同變性的蛋白質(zhì)分離，隨流動(dòng)相一起流出色譜柱，又因HIC固定相能提供較常法高出十至數(shù)百倍的能量*，在變性蛋白質(zhì)被HIC固定相吸附的同時(shí)瞬時(shí)除去以水合狀態(tài)附著在蛋白質(zhì)表面和與固定相表面接觸區(qū)域的小分子*，而蛋白質(zhì)的特定的疏水性氨基酸殘基與HIC固定相表面作用以形成區(qū)域立體結(jié)構(gòu)，接著形成折疊中間體，隨著流動(dòng)相的不斷變化，變性蛋白質(zhì)不斷地在固定相表面上進(jìn)行吸附-解吸附-再吸附，并在此過(guò)程中逐漸被復(fù)性，形成與天然蛋白質(zhì)構(gòu)象相同的蛋白質(zhì)，并流出色譜柱。HIC固定相是從高鹽溶液中吸附變性蛋白質(zhì)，且與變性劑瞬時(shí)分離，不僅大大降低了蛋白質(zhì)間的聚集作用，還因固定相在分子水平上為變性蛋白提供里很高的能量，使水化的變性蛋白質(zhì)瞬時(shí)失水，并形成局部結(jié)構(gòu)以利于蛋白質(zhì)從疏水核開(kāi)始折疊。HIC在蛋白質(zhì)復(fù)性的同時(shí)還能與其它雜蛋白進(jìn)行很好的分離，且HIC柱便宜、快速，故有很好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

5、 反膠束復(fù)性法[27]：由于蛋白質(zhì)在反膠束內(nèi)水相中可以保持其構(gòu)象和活性，運(yùn)用相轉(zhuǎn)移技術(shù)可以將蛋白質(zhì)分子包于反膠束內(nèi)，由于這樣可使蛋白質(zhì)相互分離，減少了蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中的聚集作用，通過(guò)逐漸降低變性劑的濃度和加入氧化-還原劑，可使變性蛋白質(zhì)復(fù)性，但表面活性劑對(duì)蛋白質(zhì)具有變性作用。

6、 雙水相復(fù)性法[15]：Forciniti用硫氰化鈉、氯化鈉、溴化鋰與聚乙二醇構(gòu)成的雙水相系統(tǒng)使得包涵體的溶解與蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性在一步雙水相技術(shù)操作中完成。由于PEG具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用、高濃度鹽則具有去穩(wěn)定的作用，這樣正確折疊的蛋白質(zhì)會(huì)不斷進(jìn)入到另一相中，直到蛋白質(zhì)的折疊與去折疊達(dá)到一個(gè)平衡。

蛋白質(zhì)知道如何折疊，但我們對(duì)蛋白質(zhì)折疊和聚集的機(jī)制尚不十分清楚，每種蛋白質(zhì)都有自己特有的折疊方式和途徑，因此對(duì)某種蛋白質(zhì)的復(fù)性必須反復(fù)試驗(yàn)，利用折疊和聚集的知識(shí)建立相對(duì)優(yōu)化、適合生產(chǎn)規(guī)模的方法。

參考文獻(xiàn)

[1]Lilie H, Schwarz E, Rudolph R.Advances in refolding of proteins produced in E.Coli . Curr Opin Biotechnol,1998,9(5):497-501

[2]Gribskov M, Burgess RR. Overexpression and purification of the sigma subunit of E.coil RNA polymerase. Gene,1983,26:109

[3]Lilie H, Schwarz E, Rudolph R. Advances in refolding of proteins produced in E.coli. Curr Opin Biot,1998,9:442

[4]Xie Y, Wetlaufer D B. Control of aggregation in protein refolding: the temperature-leap tactic. Protein Sci,1996,5(3):517-523

[5]Georgious G, Valax P.Expression of correctly folded protein in E.Coli. Curr Opin Biotechnol,1996,7(2):190-197

[6]Rudolph R,Bohm G, lilie H, et al. Folding proteins. In:Creighton T E ed. Protein Function: A Practical Approach, 2nd.New York: IRL,1997,57-99

[7]CowleyDT, MackinRB. Expression, purification and charaterization of recombinant human proinsulin. FEBS Lett,1997,402:124

[8]Kuruez I,Titus JA, Jost CA. Correct disulphide pairing and efficient refolding of detergent-solubilized single chain Fv proteins from bacterial inclusion bodies.Mol Immunol,1995,12:1443

[9]Stockel J, Doring K, Malotka J. Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimer classⅡ major histocompatibility complex molecular. Eur J Biochem,1997,248:684

[10]Builder S, Hart R, Lester P,et al. Refolding of misfolded insulin-like growth factor-I. US patent,PN 5 663 304,1997-09-02

[11]Zhao Qin-yi.Irreversible Thermodynamic Theory for Protein Folding and Protein thermodynamic Structures. Prog.Biochem Biophys,2001,28(3):429-435

[13]Kiefhaber T, Rudolph R,Kohler H-H et al. Protein aggregation in vitro and in vivo:a quantitative model of the kinetic competition between folding ang aggregation. Biol Technology,1991,9:825-2-829

[14]Yeh Sih, Rousseau D. Folding intermediates in cytochrome c. Natu Stru Biol,1998,5(3):222

[15]Creighton TE. How important is the molten globule for correct protein folding?Trends Biochem Sci,1997,22:6

[16]Forciniti D. Protein refolding using aqueous two-phase systems.J Chromatography A,1994,668(1):95-100

[17]de Bernardez C E. Refolding of recobinant proteins. Curr Opin Biotechnol,1998,9(2):157-163

[18]Hevehan D L,Clark E D B.Oxidative renaturation of lysizyme at high concentration. Biotechnol Bioeng,1997,54:221-230

[19]Maeda Y, Ueda T, Imoto T. Effective renaturation of denatured antibody improve its in vivo folding.Protein Eng,1995,8:81-89

[20]Simmons T,Newhous Y M, Arnold K S et al . Human low density lipoprotein receptor fragment successful refolding of a functionally active ligand-binding domain produced in E.coli.J Biol Chem,1997,272(41):25531-25536

[21]Rozema D,Gellman S H. Artificial chaperone-assisted refolding of denatured-reduced lysizyme:modulation of the competition between renaturation and aggregation . Biochemistry,1996,35(49):15760-15771

[22]Sadana A.Protein refolding and inactivation during bioseparation:bioprocessing implications.Biotech Bioeng,1995,48(5):481-489

[23]Geng X,Chang X.J Chromatogr,1992,599:185-194

[24]Suttnar J,Dyr J E,Hamsikova E et al. J Chromatogr B,1994,656(1):123-126

[25] Werner M H,Clore G M,Gronenborn A M et al . FEBS Lett,1994,345(2-3):125-130

[26] Taguchi H,Makino Y,Yoshida M.J Biol Chem,1994,269:8529-8634

[27]Hagen A J,Hatton T A, Wang D I C. Protein refolding in reverse micelles.Biotech Bioeng,1989,35(4):955-965