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      地高辛配基隨機(jī)標(biāo)記DNA探針

      放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-07

        1.標(biāo)記DNA探針 每次標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)可標(biāo)記10ng至3μg線性的DNA,也可標(biāo)記更大量的DNA,但所有的成分和體積要相應(yīng)增加。

       。1)DNA探針熱變性,煮沸10min,迅速冷卻于冰/乙醇中5min以上,待用。
       。2)取Eppendorf管(1.5ml)置于冰上,加下列及試劑:
        新鮮變性的DNA          1-3μg
        六聚核苷酸混合物         2μl(管5)
        dNTP標(biāo)記用混合底物        2μl(管6)
        加無菌重蒸水至          19μl
        DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow)   1μl(管7)
       。3)在37℃保溫至少60min,可到20h。
       。4)煮沸5min,終止反應(yīng)。
        (5)15000rpm離心30s,置于冰上待用。

        2.預(yù)雜交 按100cm2膜用20~40ml預(yù)雜交溶液,預(yù)雜交時(shí)使溶液處于流動(dòng)狀態(tài)。
        預(yù)雜交液組成:5×SSC
        0.5%(W/V)封阻試劑(管11)
        0.1%(W/V)N-十二烷酰肌氨酸鈉
        0.02%(W/V)SDS
        膜放入塑料袋,灌入預(yù)雜交液,排除氣體后密封,在65℃預(yù)雜交過夜。

        3.雜交 按100cm2膜用2.5ml雜交液,雜交時(shí)偶爾搖動(dòng)雜交袋,使里面的溶液重新分配。
        雜交液組成: 50%甲酰胺(V/V)
        5%(W/V)封阻試劑
        5×SSC
        0.1(W/V)N-十二烷酰肌氨酸鈉
        0.02%(W/V)SDS
        新變性標(biāo)記DNA(150ng/ml)

        雜交液取代預(yù)雜交液,替換間膜不能干,成功地替換應(yīng)是膜與塑料袋間形成一層雜交液膜。于42℃雜交過夜(16~20h)。

        4.洗膜  按100cm2膜用250ml洗膜液計(jì)算。
       。1)在室溫下用2×SSC/0.1%(W/V)SDS溶液漂洗,5min,2次。
        (2)在65℃條件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗,10min,2次。
       。3)在室溫下用2×SSC溶液漂洗1次。

        5.免疫測定

       。1)配制溶液
        緩沖液1:Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃)
        緩沖液2:0.5%(W/V)封阻試劑(管11),配制于緩沖液1中(封阻試劑不會(huì)快速溶解,因此應(yīng)預(yù)早1h前配制此溶液,將試劑溶于50~70℃,此溶液保持混濁)。
        緩沖液3:Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2(500mmol/L)pH9.5(20℃)。
        緩沖液4:Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)
        顯色溶液:新鮮配制,在10ml緩沖液3中,加45μlNBT溶液(管9)和35μlX-磷酸鹽緩沖液(管10)。

        2. 顯色過程
        A.膜在緩沖液1中短暫洗滌(1min)。
        B.在100ml緩沖2中保溫30min。
        C.再用緩沖液1短暫洗滌。
        D.用緩沖液1稀釋的抗體結(jié)合物(管8)至150U/L(1:5000);稀釋后的抗體結(jié)合物在4℃只能穩(wěn)定12h。
        E.膜在20ml稀釋的抗體結(jié)合物溶液中保溫30min。
        F.用100ml緩沖液1洗膜,以除去未結(jié)合的抗體結(jié)合物,15min,2次。
        G.膜在緩沖液3中平衡2min。
        H.在黑暗條件下,膜與10ml顯色溶液放入塑料袋內(nèi)密封或放入合適的盒子內(nèi),幾分鐘內(nèi)開始出現(xiàn)顏色,一般顯色反應(yīng)在1天后全部完成。當(dāng)顏色顯影時(shí),不可振蕩或攪拌。
        I.當(dāng)要求的點(diǎn)或帶已被檢測時(shí),可用50ml緩沖液4洗膜5min終止反應(yīng)。
        J.?dāng)z相。
        說明:上述各反應(yīng)均在室溫下進(jìn)行,除了顯色反應(yīng)外,均需振蕩或攪拌。

       。ㄎ澹┡懦龑(shí)驗(yàn)中問題的方法

        1.DNA不能有效地被標(biāo)記時(shí)考慮
        (1)用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀,重新純化DNA。
       。2)標(biāo)記反應(yīng)的保溫時(shí)間延長(增至20h)。
       。3)DNA變性或許不完全,這時(shí)對大片段DNA特別重要。

        2.不能達(dá)到預(yù)期的靈敏度時(shí)考慮
        (1)DNA標(biāo)記率。
       。2)增加標(biāo)記DNA的濃度或增加雜交時(shí)間。
       。3)顯色反應(yīng)的時(shí)間可延長至3d。

        3.若顯色時(shí)背景過深,可采取
        (1)在雜交溶液中減少標(biāo)記DNA量。
        (2)增加雜交溶液的體積,使膜隨意漂浮在溶液中。
       。3)某些類型的尼龍膜可能產(chǎn)生深色背景,因此可采用其它類型的尼龍膜或改用硝酸纖維素膜。
       。4)在雜交和檢測過程中增加封阻試劑的濃度。

       

       

       
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